本周分享的文献是2023年4月发表在ACS Nano 期刊上一篇题为“Neutrophil-Membrane-Coated Biomineralized Metal−Organic Framework Nanoparticles for Atherosclerosis Treatment by Targeting Gene Silencing”的文章，研究发现中性粒细胞膜包覆的生物矿化金属有机骨架纳米粒子可通过靶向基因沉默治疗动脉粥样硬化。
动脉粥样硬化是冠状动脉疾病、中风等致命性心血管疾病的主要原因。血管炎症通过多种途径参与动脉粥样硬化的形成。目前，药物治疗是治疗动脉粥样硬化最常用的方法。然而，临床上全身用药疗效有限，可能是由于药物清除迅速、在动脉病变部位蓄积不足所致。此外，长期用药还会产生肝损伤等副作用。鉴于以上问题，需要开发更有效、可靠的方法来预防和治疗动脉粥样硬化炎症。
反义寡核苷酸（ASO）基因沉默已被广泛用于治疗各种疾病。将 ASO 链引入细胞质中存在的 RNA 诱导沉默复合物中，就可以切除靶基因以产生有效的沉默。此外，ASO 与胞质溶胶中存在的微小 RNA （miR）结合也能降低特定基因的表达。其中microRNA-155（miR-155）被认为是动脉粥样硬化中的炎症调节剂。miR-155可以靶向NF-κB负调节剂BCL6并抑制其表达，从而增加RELA（内皮细胞中一种富含促炎性的NF-κB亚基）及其下游靶基因细胞内细胞粘附分子-1（ICAM-1）和CCL2的表达。miR-155的过表达通过激活NF-κB来增加动脉内皮细胞的炎症反应和单核细胞募集，表明抑制miR-155可能减轻动脉粥样硬化。因此，基于反义寡核苷酸拮抗miR-155是一种很有前途的治疗动脉粥样硬化疾病方法。但抗miR-155在体内的有效递送，存在包括吞噬系统快速清除、动脉粥样硬化斑块靶向、内源性核糖核酸酶降解和逃逸内体的问题。简而言之，开发安全有效的纳米载体以将抗miR-155精确递送至动脉粥样硬化病变部位，随后逃逸出内体并释放抗miR-155进入细胞质仍然是一个棘手的问题。
作者在此开发了一种仿生方法，用于将抗 miR-155 有效载荷靶向递送至炎性动脉粥样硬化病变（图 1）。为了实现理想的负载效率和有效的溶酶体逃逸，选择了沸石咪唑酯骨架-8（ZIF-8）作为核心结构（AM@ZIF）来负载抗 miR-155。然后将中性粒细胞膜（NM）涂覆在 AM@ZIF 纳米粒子的表面上，以制造“核壳”结构的仿生纳米复合物（AM@ZIF@NM）。经静脉注射后，形成的仿生纳米复合物可通过纳米粒子上的NM 蛋白 CD18 与ICAM-1相互作用，主动靶向动脉粥样硬化病变中的内皮细胞，并释放抗 miR-155 拮抗剂进入内皮细胞胞浆。
图1：中性粒细胞膜包被抗 miR-155 的 ZIF-8 纳米粒子靶向治疗动脉粥样硬化示意图
实验结果
首先对AM@ZIF NPs 通过透射电子显微镜（TEM）表征，结果显示单分散纳米粒子的平均尺寸为 68.5 ± 7.9 nm。涂覆 NM 后，在 AM@ZIF NPs 表面观察到额外的暗化层。 NM 涂覆后，AM@ZIF NPs 的电位从 −23 mV 变为 −25 mV，AM@ZIF NPs 的流体动力学直径从 ∼98.0 nm 变为 ∼127.8 nm，表明 NM 成功涂覆在 AM@ZIF NPs 表面。AM@ZIF 紫外可见吸收光谱显示，anti-miR-155 在 260 nm 具有特征吸收，这在纯 ZIF-8 中没有观察到，进一步证明 anti-miR-155 成功封装到 ZIF-8 中。此外，X 射线衍射（XRD）数据证实 AM@ZIF 纳米结构和纯 ZIF-8 纳米结构均保持了高结晶度。SDS-PAGE 结果表明，大多数中性粒细胞膜蛋白转移到 AM@ ZIF@NM NPs 的表面。免疫印迹证实 AM@ZIF@NM NPs 的关键表面蛋白 CD18 存在并富集，这可以赋予 NPs 炎症内皮靶向特性。由于 Zn2+ 与 2-甲基咪唑的酸性非共价键，ZIF-8 NPs 具有 pH 敏感的生物降解性。在酸性刺激（pH5.5）下加速了 anti-miR-155 的释放，这是由于锌/咪唑配位键的解离。
图2：AM@ZIF@NM NPs 的表征
接下来，研究 AM@ZIF@NM NPs 对炎症 MAEC 的靶向性。为了追踪细胞摄取过程，将 Cy5 标记在抗 miR-155 上并分别封装以制备 Cy5-AM@ZIF NPs 和 Cy5-AM@ZIF@NM NPs。与Cy5-AM@ZIF@NM NPs孵育4小时后，在活化的炎症MAEC中观察到强的红色荧光，而非活性MAEC仅发出微弱的荧光，表明Cy5-AM@ZIF@ NM NPs被炎症MAEC大量摄取。流式细胞术结果与共聚焦荧光图像的结果一致。本研究设计将anti-miR-155递送至炎症MAEC，沉默miR-155并增加BCL6的表达，从而抑制NF-κB通路的激活。为研究miR-155的沉默效果，qRT-PCR检测发现将miR-155转染入MAECs后，其靶基因BCL6表达水平降低，RELA、ICAM-1、CCL2表达水平明显升高，提示miR-155激活了NF-κB通路。然而，将激活的MAECs与AM@ZIF@NM NPs孵育后，miR-155表达水平明显降低，BCL6的表达有所提升。同时，RELA、CCL2、ICAM-1的表达也显著降低。同时炎症 MAEC 中细胞因子 IL-6 和 CCL2 的高表达明显降低。上述结果表明，通过 AM@ZIF@NM NPs 将抗 miR-155 递送至活化的炎症 MAEC 可有效沉默 miR-155 并抑制 NF-κB 通路激活。
图3：Cy5-AM@ZIF@NM NPs 的细胞摄取及其在 MAEC 中的沉默功效
随后，作者研究了 AM@ZIF@NM NPs 在 C57BL/6 小鼠中的药代动力学特征。静脉注射 Cy5.5-AM@ZIF NPs 或 Cy5.5-AM@ZIF@NM NPs 后，体外荧光成像显示上述两种 NPs 在 24 小时后几乎全部从血液中清除。为了测试 NPs 对动脉粥样硬化斑块的靶向性，在用HFD喂养 ApoE−/− 小鼠 8 周后诱发动脉粥样硬化。通过静脉注射分别给这些小鼠施用 Cy5.5-AM@ZIF NPs 或 Cy5.5-AM@ZIF@NM NPs，在注射后 12 小时收获主动脉。离体成像显示与 Cy5.5AM@ZIF NPs 组相比，注射 Cy5.5-AM@ZIF@NM NPs 的小鼠分离的主动脉组织中的荧光明显更高。此外，免疫荧光成像显示，许多 Cy5.5-AM@ZIF@NM NPs 聚集在动脉粥样硬化主动脉内皮细胞中，而观察到的 Cy5.5-AM@ZIF NPs 很少。这些结果表明，纳米颗粒上的 NM 修饰显著增强了 NPs 的靶向性。
图4：Cy5.5@ZIF@NM NPs 静脉注射后在小鼠体内循环及靶向能力
在确认体内抗 miR-155 递送后，作者接下来评估了 AM@ZIF@NM NPs 的抗动脉粥样硬化潜力。将 ApoE−/− 小鼠分为四组。在用 HFD 治疗的第五周，每组分别以每周 0.65 mg/kg 抗 miR-155 的剂量静脉注射 PBS、游离抗 miR-155、AM@ ZIF NPs 和 AM@ZIF@NM NPs，持续另外 9 周。在治疗结束时，收集主动脉并用 油红O 染色，得到的红色区域显示斑块区域。发现AM@ ZIF@NM NPs治疗的治疗效果显著提高，斑块率为6.77%，表明有效抑制了动脉粥样硬化的进展。主动脉根部、主动脉弓和头臂动脉的油红O染色冰冻切片获得了与上述类似的结果，显示AM@ZIF@NM NPs具有有效的抗动脉粥样硬化活性。这些结果表明AM@ZIF@NM NPs可有效减缓动脉粥样硬化的进展。
图5：AM@ZIF@NM NPs 对 ApoE−/−小鼠的治疗效果
通过对 ApoE−/− 小鼠的主动脉根部进行组织学和免疫组织化学分析。可以看到PBS 治疗组（对照组）出现大块坏死核心，表明病变严重。相反，在 AM@ZIF@NM NPs 治疗组中，坏死核心面积显著减少。对 CD68（巨噬细胞标志物）和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的免疫组织化学分析显示，AM@ZIF@NM NPs 显著降低了主动脉根部斑块中巨噬细胞的含量和 MMP-9 的表达。相比之下，血管平滑肌细胞（VSMCs）的增殖和胶原浓度的增加被认为在动脉粥样硬化形成的所有阶段都是有益的。抗 α 平滑肌肌动蛋白（α-SMA）抗体染色显示，用AM@ZIF@NM NPs治疗后，病变区域的SMC数量显著增加。与此结果一致，用Masson三色染色显示胶原蛋白的浓度也大大上调。这些发现表明AM@ZIF@NM NPs稳定了斑块的进一步发展并抑制了动脉粥样硬化的形成。
最后，作者还研究了主动脉中 miR-155 靶基因 BCL6 和促炎性 NF-κB 亚基 RELA 的表达。如预期的那样，在用 AM@ZIF@NM NPs 治疗的小鼠中 BCL6 表达得到显著恢复，但在游离抗 miR-155 或 AM@ZIF NPs 组中没有恢复，且AM@ZIF@ NM NPs 治疗的小鼠主动脉中 RELA 的表达降低。同时，在 AM@ZIF@ NM NPs 治疗组中观察到主动脉组织中主要促炎细胞因子IL-6 和 CCL2的表达最低。因此，这些数据表明 AM@ZIF@NM NPs 有效减轻了主动脉局部炎症。综合起来，一系列证据表明 AM@ZIF@NM NPs 对 ApoE−/− 小鼠的动脉粥样硬化具有优异的治疗效果，并且表明治疗效果优于 AM@ZIF NPs。
图6：AM@ZIF@NM NPs 改善了 ApoE−/−小鼠的斑块和炎症
结论
综上所述，作者成功制备了用于有效递送核酸载荷的仿生纳米复合物。以载有抗miR-155的MOF纳米粒子为核心，以NM为外壳，合成了一种治疗动脉粥样硬化的有效配方。MOF纳米粒子不仅具有高负载能力，而且在内体区室解离后还有利于抗miR-155释放到胞质溶胶中。NM涂层实现了对动脉粥样硬化斑块区域发炎内皮细胞的特异性靶向性。最终的抗miR-155纳米疗法能够有效延缓动脉粥样硬化的进展，主要是通过抑制NF-κB通路激活和减少炎症来实现的。体外和体内实验均表明，制备的AM@ZIF@NM NPs具有显着的炎症趋向性和炎症缓解作用。这种纳米治疗策略有望成为未来针对动脉粥样硬化甚至许多疾病的实用靶向治疗。
汇报人：李瑶