本周分享的文献是在2022年04月01日发表在Nature Communications的文章，题目是Single-cell and spatial analysis reveal interaction of FAP+ fibroblasts and SPP1+ macrophages in colorectal cancer，通讯单位是上海交通大学和中国科学技术大学。本研究聚焦于结直肠癌（CRC）的肿瘤微环境（TME），通过分析来自肿瘤和邻近组织的超过54,000个细胞，研究人员发现FAP+成纤维细胞和SPP1+巨噬细胞在肿瘤组织中显著富集，并且其相互作用与患者预后较差和对免疫治疗的抵抗有关。针对这些细胞相互作用的潜在治疗策略可能会提高免疫治疗的效果。
研究背景
结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是第三大常见恶性肿瘤（仅次于肺癌和乳腺癌）。T 细胞免疫治疗是常见的抗肿瘤方式，PD-程序性细胞死亡配体1，在许多细胞类型上表达，尤其在肿瘤细胞和某些免疫细胞中，它主要通过与T细胞表面的PD-1受体结合，抑制T细胞的活性，从而降低免疫系统对肿瘤细胞的攻击。然而PD-1靶向抗体 (pembrolizumab )只对错配修复缺陷和高微卫星不稳定性（MSI-H）的肿瘤有效，而这类肿瘤在转移性 CRC 病例中的比例不到 5%。因此，需了解CRC肿瘤微环境(tumor microenvironment，TME)中细胞和分子重塑机制，以寻找潜在干预靶点来提高免疫治疗疗效；研究发现，基质细胞和髓样细胞可能形成一个独特的肿瘤生长和转移生态位，使其成为潜在的治疗靶标。SPP1+巨噬细胞具有免疫抑制特性，并且与 EMT 标志物呈正相关，是抗肿瘤生长和转移的潜在靶标。
结果1：人正常粘膜和 CRC 组织的单细胞转录组图谱
为了阐明结直肠肿瘤的细胞组成，作者对5名非转移性患者的肿瘤样本和邻近正常组织进行了单细胞测序，降维聚类后用marker基因标记识别出结直肠癌及其邻近组织中的九种主要细胞类型，包括上皮细胞、T/ILC细胞、B细胞、浆细胞、髓系细胞、肥大细胞、内皮细胞、间充质基质细胞（MSCs）和胶质细胞，这9种细胞在肿瘤和正常组织中的浸润等级都不同，可能反映了CRC进展阶段的差异。
图1 肿瘤和邻近组织细胞组成的UMAP图，展示了不同细胞群体的分布情况
结果2：CRC 患者肿瘤组织中细胞群特征揭示了 TME 的标志性特征和临床结局的预测
为了研究肿瘤浸润细胞亚群调控网络的变化，作者利用Molecular Signatures Database（MsigDB）的 hallmark 基因集来分析相邻正常组织和肿瘤组织之间MSCs、ECs、神经胶质细胞、髓样细胞、T细胞和B细胞通路的变化(图2a)。与正常组织相比，肿瘤中的免疫相关通路（包括炎症反应、IL2/STAT5 信号和 IL6/JAK/ STAT3 信号）不仅在免疫细胞群(如髓样细胞和T/ILC细胞)中丰富，在 MSCs 和 ECs中也富集(图2a)，这表明 MSCs 和 ECs 参与了结直肠癌的免疫应答。与正常样本相比，肿瘤 MSCs、ECs 和髓样细胞中缺氧相关的 Hallmark 基因被富集(图2a)。这可能反映了肿瘤缺氧区的基质细胞相互作用，将巨噬细胞、MSCs 和 ECs 连接起来，重塑 CRC 微环境。此外，与正常组织相比，肿瘤髓样细胞和 T/ILC 表现出更丰富的代谢相关基因(图2a)，这表明免疫代谢在CRC TME 中被重编程。
为了预测bulk转录组中细胞的浸润情况，作者先用单细胞数据集对CIBERSORTx的可靠性进行评估，发现cibersortx得到的细胞类型及其比例与单细胞的相近。于是用CIBERSORTx分析了14个队列的细胞浸润情况和相关性分析，观察到MSC和骨髓细胞之间存在显著的正相关（图2b-c）。 为了评估TME中每种细胞类型浸润的临床相关性，检查了细胞浸润与CRC患者总生存期（OS）和无进展生存期（PFS）的相关性，结果显示MSC细胞浸润较高/髓系细胞浸润较高的患者的 OS和 PFS都较差。
图2 MSCs与髓系细胞在肿瘤浸润中呈正相关，并与临床预后相关
结果3：肿瘤特异性 FAP+ 成纤维细胞与结直肠癌进展相关
MSC被认为是参与调节肿瘤发生和癌症进展的关键细胞类型，作者根据报道过的标记物将MSC分为10种亚型。为了验证FAP+成纤维的特异性，作者整合了肿瘤相关的MSC单细胞数据集，发现FAP+成纤维细胞、增殖成纤维细胞和周细胞在肿瘤组织中显著富集。之后作者使用CIBERSORTx估计了TCGA-CRC和其他12个bulk数据集中细胞类型的丰度，发现 FAP+成纤维细胞同样在肿瘤样品中显著富集，而且FAP+成纤维细胞浸润程度较高的患者PFS更短。 流式细胞术分析了基质细胞亚型标志物 CD24、CD26、NT5E、FAP 和 FGFR2 的表达（图3g），结果显示，肿瘤样本中 FAP+ 成纤维细胞的浸润显著增加，而NT5E+和FGFR2+ 成纤维细胞显著减少。
对MSC亚群进行了 RNA“速度”分析，FAP+ 成纤维细胞可能源自 FGFR2+ 成纤维细胞或 ICAM1+ 端粒细胞，接着进行了转录因子分析展示了表达量和活性前5的TF，发现 Twist1在 FAP+ 成纤维细胞的中具有最高的表达和活性水平，可能是驱动该分化途径的主TF（图3i-j）。与其他MSC亚型相比，缺氧依赖性 HIF-1α信号通路在该细胞中显著富集。
图3 正常黏膜和肿瘤组织基质细胞的特征
结果4:肿瘤特异性SPP1+巨噬细胞与结直肠癌进展相关
接下来作者对髓系细胞进行分亚群，发现巨噬细胞和中性粒细胞群主要存在于肿瘤组织中，而DC富集于正常组织中，而且SPP1+巨噬细胞是肿瘤特异性巨噬细胞(图4a-b).免疫浸润发现SPP1+巨噬细胞在肿瘤样本中的显著上调。在SPP1+巨噬细胞浸润较高的TCGA和 GSE17536 CRC 队列中，CRC患者表现出较短的PFS。RNA 速率发现SPP1 + 巨噬细胞可能来源于THBS1+巨噬细胞，转录因子分析发现 STAT1可能是SPP1 +巨噬细胞的主TF，SPP1+巨噬细胞也可能受到HIF-1 信号通路的调节。由于 FAP+成纤维细胞和SPP1 +巨噬细胞与缺氧诱导的通路密切相关，作者假设肿瘤缺氧区域存在基质细胞介导的网络，该网络连接巨噬细胞和MSCs，它们共同加剧CRC微环境。
图4 正常粘膜和肿瘤组织中髓系细胞的特征
结果5:FAP+成纤维细胞和SPP1+巨噬细胞的高浸润与较差的患者生存率相关
CIBERSORTx评估了scRNA-seq的细胞类型在14个独立CRC队列中的浸润情况以及细胞间的相关性，发现 FAP+ 成纤维细胞和SPP1 +巨噬细胞相关性最高（图5a）。又比较了具有不同水平FAP+成纤维细胞和SPP1+巨噬细胞的患者的PFS，观察到高 FAP+ 成纤维细胞和 SPP1+ 巨噬细胞患者表现出最短的 PFS，表明这两种细胞类型可以协同促进肿瘤进展。GSEA分析显示在高FAP+ 成纤维细胞和高SPP1 +巨噬细胞样本中上调的基因富集在上皮-间充质转换和缺氧通路。
作者通过H评分系统评估了78 名CRC患者组织微阵列中的蛋白质表达水平，发现肿瘤组织中的FAP 和 SPP1 均特别增加（图5d-e），而且FAP 或 SPP1 蛋白水平高的患者表现出更短的OS（图5f-g）。免疫荧光标记进一步证明了肿瘤组织中SPP1 阳性和 FAP 阳性细胞非常接近（图5I），这意味着这两种细胞之间可能存在串扰。
图5 FAP+成纤维细胞和SPP1+巨噬细胞的高浸润与更差的患者生存和免疫治疗耐药性相关
结果6:空间转录组学揭示FAP+成纤维细胞和SPP1+巨噬细胞的细胞间相互作用
作者对4名CRC患者的肿瘤组织切片进行了空间转录组学，降维聚类后患者6分为了10簇，患者7的斑点分为（图6a-f）。将单细胞数据分析得到的FAP+ 成纤维细胞或SPP1+巨噬细胞的前25个特异性表达基因在肿瘤组织切片中进行查看，结果显示每个簇中的评分点突出显示了二者共定位在同一点的簇，并包裹在恶性上皮细胞周围（图6g-i）。此外FAP+成纤维细胞或SPP1 +巨噬细胞的特征评分显示显著的正相关。对4个样本的这2种细胞富集分析，发现有助于形成结缔组织增生结构的途径中高度活跃的斑点，包括细胞外基质组织、胶原纤维组织和对TGF-β的反应（图6i）。免疫相关T细胞或B细胞被排除在肿瘤核心之外（图6m）。说明结肠纤维增生性微环境可能受到FAP+成纤维细胞和SPP1+巨噬细胞相互作用的调节，从而限制免疫细胞浸润到肿瘤核心，降低免疫治疗疗效。
图6 空间转录组学揭示FAP+成纤维细胞和SPP1+巨噬细胞的共定位
结果7:FAP+成纤维细胞和 SPP1+巨噬细胞相互作用可能有助于结缔组织增生性肿瘤微环境
作者对上述2种细胞进行细胞通讯分析，发现FAP+成纤维细胞通过粘附配体-受体对直接与SPP1+巨噬细胞接触，通过TGF-β超家族基因增强 SPP1+巨噬细胞的促炎活性，WNT5A-FZD2和CCL3-CCR5还增强了对SPP1+巨噬细胞的募集。FAP+成纤维细胞还通过RARRES2-CMKLR与SPP1 +巨噬细胞相互作用，此外RARRES2在FAP+成纤维细胞高表达（图7b），CMKLR1在PP1+巨噬细胞中高表达，CRC患者血浆中的趋化蛋白水平明显高于正常组（图7d）。
由前面分析可知，ECM相关通路的基因在这2种细胞中富集，猜测SPP1+巨噬细胞可能促进 FAP+ 成纤维细胞的 ECM 重塑能力。
SPP1+巨噬细胞显示出TGFB1、IL1B和IL1A高配体活性，与FAP+成纤维细胞相应的受体结合导致编码胶原蛋白或基质金属肽酶的靶基因的表达。对KEGG 通路的基因集和细胞外基质进行了NicheNet配体活性分析，靶基因极有可能属于细胞因子-细胞因子受体相互作用、细胞外基质通路、TNF 信号通路和 TGF-β信号通路。进一步探索了前 3 个配体和 ECM相关靶点之间的信号通路，发现了40个下游调节因子，它们参与连接 SPP1+ 分泌的配体信号通路和 ECM 靶基因，有助于促组织增生区的形成。
图7 FAP+成纤维细胞和SPP1+巨噬细胞的互作网络
结果8:FAP+ 成纤维细胞和 SPP1+ 巨噬细胞的高浸润与免疫治疗耐药性相关
最后分析了这2种细胞浸润的肿瘤局部免疫特征，发现FAP+成纤维细胞高、SPP1+巨噬细胞高组中的肿瘤样本显示出相对较高的非沉默突变、单核苷酸变异、更高的熵指数和 TCR 丰富度，但淋巴细胞浸润较低，这反映了T细胞对新抗原的无效反应。
目前肿瘤免疫治疗主要针对淋巴细胞，作者预测减少此类肿瘤的淋巴细胞浸润会抑制免疫治疗的效果，使用公共数据集中接受抗PD-L1 治疗的膀胱癌患者的生存时间与FAP或 SPP1 表达进行了关联分析。FAP或SPP1表达水平高的患者对PD-L1抗体治疗的反应显示OS受损，表现出较短的生存时间，而且患者疾病进展(PD）更严重（图8i），表明富含FAP或SPP1的患者对抗 PD-L1 治疗的反应明显差于其他患者。
图8 SPP1+巨噬细胞和FAP+成纤维细胞影响患者TME中淋巴细胞的浸润
结论
FAP+成纤维细胞受TWIST1调节，其表达由缺氧诱导；还分泌化学素，并与THBS1+巨噬细胞结合，驱动其分化成SPP1+巨噬细胞。而SPP1+巨噬细胞可能通过TGFB1调节FAP+成纤维细胞，从而促进MMP和胶原蛋白的分泌，共同促进ECM的重塑。总的来说，FAP+成纤维细胞和SPP1+巨噬细胞形成一个相互作用网络，促进TME纤维增生区域的形成，防止淋巴细胞浸润肿瘤核心，进一步降低 PD-L1 治疗的疗效。
汇报人：许婵