本周分享的文献是 2024年10月发表在国际杂志Cell Immunity 题为“Notch signaling regulates macrophage-mediated inflammation in metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease”的文章，主要聚焦的是Notch信号通路调节肝脏巨噬细胞炎症进而参与MASLD。
背景：代谢功能障碍相关的脂肪性肝病（MASLD）是一种常见的慢性肝病，可以从单纯性脂肪肝发展为代谢相关的脂肪性肝（MASH），进而可能导致肝硬化和肝细胞癌，但目前没有有效的治疗方法来阻止其从MASLD进展为MASH。研究发现，免疫细胞，特别是巨噬细胞，在MASH的病理过程中发挥重要作用。肝脏中的巨噬细胞主要包括驻留的Kupffer细胞（KCs）和单核细胞来源的巨噬细胞（MDMs），后者在炎症期间被招募并参与病理过程。Notch信号通路被认为在巨噬细胞的分化和功能中起到关键作用。尤其是由肝窦内皮细胞（LSECs）表达的Notch配体Dll4在MASH中升高，表明其在疾病进展中的作用。通过整合单细胞RNA测序、谱系追踪和条件性基因敲除小鼠模型，研究旨在揭示Notch信号途径，特别是RBPJ蛋白在单核细胞向巨噬细胞分化中的时空调控机制，从而更好地理解这一过程在MASH病理中的作用。
1.MASH过程中的动态单核细胞募集
为了评估MASH中的KCs和单核细胞来源的巨噬细胞(MDMs)动态，作者用缺乏蛋氨酸和胆碱的饮食(MCDD)喂养Ms4a3CreRosaTdT命运映射小鼠(图S1A)。这种饮食导致的情况反映了在人类MASH中观察到的脂肪变性、炎症和纤维化(图S1B和S1C)，而小鼠基因修饰可以在体内示踪超过95%的单核细胞。这使作者能够区分Tomato+ MDMs和肝脏中胚胎来源的Tomato‒KCs (图S1D)。
与喂食正常饮食(ND)的对照小鼠相比，作者在MCDD喂养的MASH Ms4a3CreRosaTdT小鼠中观察到Tomato+Tim4+巨噬细胞积累(图1A和1B)，突出了先前报道的MoKc样细胞的募集。然后作者根据Tim4的表达评估了肝巨噬细胞的Tomato标记，观察到Tim4+ KCs在稳态下几乎没有任何Tomato表达，而50%的Tim4‒巨噬细胞被标记(图1C和1D)。在MCDD诱导的MASH中，单核细胞来源的细胞比例在Tim4+ KCs和Tim4‒巨噬细胞两个群体中均增加，两个细胞群中的Tomato标记比例分别为30%和80% (图1C和1D)。这些结果证实，在MCDD诱导的MASH中大量单核细胞浸润肝脏，其中一部分分化为MoKCs，与先前的结果一致。
为了了解MASH过程中MDMs的定位，作者使用F4/80标记、Tomato表达和注入血液的葡聚糖染料对ND和MCDD喂养的Ms4a3CreRosaTdT小鼠的肝脏进行了活体成像(能够将肝窦腔与Disse间隙和肝实质区分开)。与非脂肪变性肝脏相比，MASH中定位于Disse间隙的Tomato+F4/80+ MDMs显著增加(图1E-1G)。此外，虽然KCs优先定位于门静脉周围(peri-PV)区域(图1E)，与报道的一致，但大多数Tomato+ MDMs分布在中心静脉(CV)区域附近，并与MASH中的其他免疫细胞聚集在一起(图1F)。
作者还使用可诱导的Ms4a3CreERT2RosaTdT小鼠模型研究了MASH期间Ly6Chi单核细胞募集的动力学。在该模型中，他莫昔芬处理将Ly6Chi血液循环中的单核细胞标记5天，在它们被募集并分化为巨噬细胞后这种标记将保持在组织中。因此，它能够让作者对它们在MASH进展期间进入肝脏进行计时。作者在MCDD喂养2周后给予他莫昔芬处理，并在时间标记后3天至4周示踪Tomato+F4/80+巨噬细胞(图1H和S1E)。作者在他莫昔芬处理后3天在F4/80+巨噬细胞中检测到相当比例的Tomato+细胞，但在4周后几乎消失(图1I和1J)。随着Tomato+F4/80+巨噬细胞和Tomato+ Ly6Chi单核细胞的比例迅速减少，Tomato+F4/80+巨噬细胞获得了Tim4的表达(图1K和1L)。这些观察结果表明，Ly6Chi单核细胞在MASH发展过程中被迅速募集到肝脏并分化为肝脏内的MDMs，但半衰期较短，表明MASH期间单核细胞募集是动态和持续的。
Figure 1. Dynamic monocyte recruitment during MASH
Figure S1. Dynamic monocyte recruitment during MASH, related to Figure 1
2.RBPJ信号是MASH中单核细胞向巨噬细胞转变所必需的
Notch信号参与单核细胞向kupffer样细胞(MoKCs)的分化，并有助于KC身份的印记。了研究Notch信号在这一过程中的重要性，作者构建了Lyz2CreRbpjfl/fl条件性遗传敲除小鼠，该小鼠品系在表达 Lyz2的髓系细胞中缺乏Rbpj。作者通过qPCR证实了在Ly6Chi单核细胞和KCs中缺乏Rbpj表达(图S2A，简称为Lyz2CreRbpjfl/fl小鼠)。与野生型(WT)相比，作者在MCDD喂养的Lyz2CreRbpjfl/fl小鼠中观察到Tim4‒F4/80+ MDMs显著减少(图2A-2C)。这种差异不能用不同的增殖或凋亡来解释(图S2B-S2D)；然而，与MCDD喂养的WT小鼠相比，Lyz2CreRbpjfl/fl小鼠的Ly6Chi单核细胞密度显著降低(图S2E)，表明单核细胞募集和分化减少。Lyz2CreRbpjfl/fl小鼠肝脏中Tim4‒巨噬细胞数量的减少可能是单核细胞向巨噬细胞的转变缺陷所致。为了验证这一假设，作者使用了Rbpj表达(Ms4a3CreRosaTdT)或Rbpj缺陷(Ms4a3CreRbpjfl/flRosaTdT)的Ms4a3CreRosaTdT命运映射小鼠。作者发现，在MASH情况下，Ms4a3CreRbpjfl/flRosaTdT小鼠总肝脏巨噬细胞中的Tomato+ MDMs比例显著低于Ms4a3CreRosaTdT小鼠(图2D-2F)。与此一致的是，活体成像显示Ms4a3CreRbpjfl/flRosaTdT小鼠肝窦和Disse间隙内的Tomato+F4/80+ MDMs均少于Ms4a3CreRosaTdT小鼠(图S2F)。因此， Rbpj缺乏会损害MDM分化。
接下来，作者建立了竞争性骨髓(BM)移植嵌合小鼠模型，该模型中用50:50混合的来自CD45.1+ C57BL/6小鼠以及CD45.2+ WT (Rbpjfl/fl)或Lyz2CreRbpjfl/fl小鼠的BM细胞对受辐照的CD45.1+CD45.2+小鼠进行造血重建(图2G)。2个月后分析髓系细胞嵌合现象，发现来自两个供体的经典Ly6Chi单核细胞在BM、血液和肝脏中的重构是相同的(图2H,S2G和S2H)，表明BM单核细的胞生成不需要RBPJ。然后作者用ND或MCDD喂食嵌合小鼠。ND喂养的条件下与WT和CD45.1嵌合组中来自两种供体的肝脏巨噬细胞重构几乎相同相比，Lyz2CreRbpjfl/fl和CD45.1嵌合组中不到20%肝脏巨噬细胞来自Lyz2CreRbpjfl/fl (CD45.2+)供体(图2H和2I)。作者进一步观察到，在喂食MCDD4周后，肝脏巨噬细胞中Lyz2CreRbpjfl/fl (CD45.2+)来源的不到30%，而WT来源的约60% (CD45.2+)(图S2I-S2K)。这表明在ND和MCDD喂养的条件下，尽管单核可以迁移到肝脏，但募集的Rbpj缺陷Ly6Chi单核细胞分化为巨噬细胞的能力较差。为了排除辐照对这种嵌合模型的可能影响，作者使用联体共生小鼠模型证实了这些数据，在该模型中C57BL/6 (CD45.1+)和Lyz2CreRbpjfl/fl (CD45.2+)小鼠的循环系统连接在一起喂食ND 2个月，然后继续连接一个月喂食MCDD (图2J)。正如预期，虽然没有观察到明显的联体共生对Tim4+ KCs的贡献，但作者发现Rbpj缺陷Ly6Chi单核细胞(CD45.2+)在C57BL/6 (CD45.1+)和Lyz2CreRbpjfl/fl (CD45.2+)肝脏中分化为Tim4‒巨噬细胞的能力较差(图2K和2L)。这些结果表明，Rbpj缺陷的单核细胞在MASH中不能像表达RBPJ的单核细胞那样分化为MDMs，支持了RBPJ信号在Ly6Chi单核细胞向MDMs转变的命运决定中的重要作用。
Figure 2. RBPJ signaling is required for the monocyte-to-macrophage transition in MASH
Figure S2. RBPJ signaling regulates monocyte-to-macrophage transition in MASH, related to Figure 2
3.RBPJ调节MASH中单核细胞来源的巨噬细胞分化
为了更好地了解单核细胞和巨噬细胞群体是如何通过MASH中的NOTCH信号形成的以及潜在的分子机制，作者对ND与MCDD喂养的WT和Lyz2CreRbpjfl/fl小鼠中富含巨噬细胞的免疫细胞进行了单细胞RNA测序(scRNA-seq)。对ND和MCDD喂养的WT和Lyz2CreRbpjfl/fl组进行无监督聚类分析鉴定出17个细胞簇(图S3A;表S1)，并根据其经典或标志基因的表达对其身份进行注释(图S3B)。为了更好地识别与MASH相关的单核细胞和巨噬细胞簇，作者将数据与来自西方饮食(WD)诱导的MASH或MASLD小鼠模型的两个公开scRNA-seq数据集进行整合，结果鉴定出9个单核细胞和巨噬细胞亚群，其中包括两个单核细胞群。一个表达Ly6c2、S100a8、S100a9、Vcan、Sell和Thbs1，而一个不表达Ly6c2但是表达Ace、Klf4和Ear2，分别对应Ly6Chi和Ly6Clo单核细胞。此外，作者还检测到三个KC亚群，包括Timd4+ KCs (ResKCs；Cd163、Folr2、Timd4、Clec4f、Vsig4和Slc40a1)，Timd4‒ KCs (MoKC；Lyve1和Marco)和增殖的KCs (Top2a、Ube2c、Mki67和Stmn1)以及四个Clec4f‒巨噬细胞亚群：Clec4e+巨噬细胞(Clec4e、Il1b、Il1rn、Cxcl2和Ccl4)，C1qc+巨噬细胞(Id3和Ly86)，Spp1+巨噬细胞(Spp1、Fabp5、Gpnmb、Cd63、Cd36和Cd9)和包膜巨噬细胞(C1qa、C1qb、Maf和Id3)(图3A,3B和S3C-S3F)。
在比较ND与MCDD的影响时，作者观察到MASH期间ResKCs丰度降低，Ly6Chi单核细胞、MoKCs和巨噬细胞的比例增加(图3C和3D)。在ND喂食的条件下，Rbpj缺失导致ResKCs减少，但Ly6Chi单核细胞和Ly6Clo单核细胞的相对丰度增加(图3D)。在MCDD喂食的情况下，作者观察到Lyz2CreRbpjfl/fl组中的Ly6Chi单核细胞和MoKCs相对于WT组较少，但Ly6Clo单核细胞和增殖KCs的相对更多(图3C和3D)。
为了通过流式细胞术鉴别这些单核细胞和巨噬细胞亚群，作者首先使用scRNA-seq表达数据来确定每个亚群表达的表面标志物。差异表达基因(DEG)分析显示Spp1+巨噬细胞高表达Cd36和Cd63，Clec4e+巨噬细胞相对而言高表达Ly6c2和Cd74，ResKCs高表达Timd4和Vsig4 (图S3G)。作者使用这些转录数据进行计算机模拟流式细胞术分析，并根据Cd74和Ly6c2的表达设计了一个假定的门控策略(图3E)；作者通过传统的流式细胞术分析喂食MCDD 8周后的Ms4a3CreRosaTdT小鼠肝脏的CD45+Tomato+Ly6G‒SiglecF‒细胞，并使用主要组织相容性复合物II类(MHCII)的表达替代Cd74验证了这一门控策略。在排除了Tomato+细胞中的中性粒细胞、嗜酸粒细胞和Ly6Clo单核细胞后，作者对Ly6Chi单核细胞(Ly6C+MHCII‒)和MoKCs进行了门控分选，然后对Clec4F‒ MDMs中的Clec4e+巨噬细胞(Ly6C+MHCII+)、C1qc+巨噬细胞(CD63‒CD36‒)和Spp1+巨噬细胞(CD63+CD36+)进行门控分选(图3F)。作者进一步利用相同的门控策略对CD45+CD11b+Lin‒细胞进行了分选(图3G)，其中超过80%的Clec4e+巨噬细胞和Spp1+巨噬细胞，70%的C1qc+巨噬细胞和MoKCs被Tomato标记(图3H)，表明了它们的单核细胞起源，验证了不依赖于Ms4a3CreRosaTdT背景的MDMs门控策略。分选的相应细胞群的bulk RNA-seq与scRNA-seq数据一致，从而验证了作者基于流式细胞术的分选方法。Tim4‒ MoKCs与MoKCs具有更高的相似性，而Tim4+ MoKCs与ResKCs具有更强的相似性(图3I和S3H)。因此，作者的门控策略能够不依赖于Ms4a3CreRosaTdT背景通过流式细胞术鉴定MASH诱导的单核细胞和巨噬细胞亚群。
Figure S3. Rbpj-dependent monocyte and macrophage heterogeneity during MASH unraveled by single-cell RNA sequencing, related to Figure 3
4.RBPJ调节MASH中巨噬细胞亚群的发育轨迹和空间生态位
作者通过流式细胞术进一步验证了Rbpj缺失时单核细胞和巨噬细胞群体的变化。比较MCDD喂养的WT与Lyz2CreRbpjfl/fl小鼠(图4A)发现，MoKCs、Clec4e+巨噬细胞和C1qc+巨噬细胞的相对数量没有变化(图4B)。然而，Lyz2CreRbpjfl/fl组中Clec4e+巨噬细胞、Spp1+巨噬细胞和MoKCs的绝对数量显著降低，其中C1qc+巨噬细胞受到的影响最小(图4C)。
为了验证能否在其他MASH模型中鉴定到这些亚群，作者使用了Apoe‒/‒小鼠，这些小鼠在喂食WD仅7周后就可以出现MASH病理和组织学。作者进一步构建了Rbpjfl/flApoe‒/‒和Lyz2CreRbpjfl/flApoe‒/‒小鼠用来研究Rbpj基因敲除如何影响这种互补MASH模型中的巨噬细胞亚群(图S4A)。重要的是，在该模型中发现了MoKCs、Clec4e+巨噬细胞、C1qc+巨噬细胞和Spp1+巨噬细胞，在Lyz2CreRbpjfl/flApoe‒/‒小鼠肝脏中观察到较少的MoKCs和Spp1+巨噬细胞(图S4B-S4D)。总之，这些结果表明，Rbpj缺乏在整体范围内影响Ly6Chi单核细胞向MDMs和MoKCs的分化，与C1qc+巨噬细胞相比对Spp1+巨噬细胞的影响更为明显。
接下来，作者利用轨迹推断分析探讨了这些亚群之间的相互关系。在WT和Lyz2CreRbpjfl/fl小鼠中，作者确定了从Ly6Chi单核细胞到C1qc+巨噬细胞、Spp1+巨噬细胞和MoKCs的发育轨迹，Clec4e+巨噬细胞代表了喂食MCDD的Lyz2CreRbpjfl/fl组中的中间亚群和Ly6Clo单核细胞分支(图4D)。为了验证这一轨迹，作者使用可诱导的Ms4a3CreERT2RosaTdT小鼠模型来研究Ly6Chi单核细胞的募集及其向MDMs分化的动力学，在该过程中这些细胞逐渐表达MHCII和Tim4，但失去Ly6C表达(图4E和4F)。作者首先在喂食MCDD 2周后监测Ms4a3CreERT2RosaTdT肝脏C1qc+巨噬细胞、Clec4e+巨噬细胞、Spp1+巨噬细胞和MoKCs中的Tomato标记动力学(图S4E)，并单词剂量的他莫昔芬处理后，Tomato标记了超过90%的Ly6Chi单核细胞(图1L)。作者发现在较早时间点的总Tomato+巨噬细胞中Clec4e+巨噬细胞代表了主要的巨噬细胞群，而在1周时C1qc+和Spp1+巨噬细胞的比例相同。MoKCs在他莫昔芬处理后的第2周占据主导地位，在第4周时这一比例超过90% (图4G)，表明与其他群体相比它们的半衰期更长。然而，随着时间的推移，所有亚群的绝对数量迅速下降(图4H)。继续喂食ND 4周在肝脏恢复后几乎没有检测到MoKCs (图S4F和S4G)，表明在MCDD诱导的MASH中MoKCs自我维持不能超过8周。
为了了解MASH模型小鼠中快速周转的Tomato+Clec4e+巨噬细胞的命运(它们是死亡还是分化为中间状态的C1qc+或Spp1+巨噬细胞)，作者进行了基因集富集分析(GSEA)。与其他两个MDMs亚群相比，Clec4e+巨噬细胞中的凋亡信号通路显著上调(图S4H)，其中包括死亡受体基因Fas的表达上调(图4I和S4I)。流式细胞术证实了这一观察结果，因为与WT肝脏中存在的其他单核细胞和巨噬细胞亚群相比，Clec4e+巨噬细胞显著高表达Fas (CD95)(图4J和4K)。这些数据表明Clec4e+巨噬细胞是寿命较短的MDM中间亚群，其中它们很少进展分化为C1qc+巨噬细胞、Spp1+巨噬细胞和MoKCs。
考虑到各种MDMs在基因表达和周转动力学上的巨大差异，作者想知道它们在发炎的肝脏中的定位是否存在差异。Tomato+F4/80+ MDMs主要定位于peri-CV区域(E-cadherin‒)，且其比例随着时间的推移而缩小(图S4J)。他莫昔芬给药1周后，作者检查了Ms4a3CreERT2RosaTdT MCDD肝脏切片，结果发现了Spp1+巨噬细胞(Tomato+F4/80+GPNMB+)、Clec4e+巨噬细胞(Tomato+F4/80+CLEC4E+)和C1qc+巨噬细胞(Tomato+F4/80+CLEC4E‒GPNMB‒)(图S4K)。在他莫昔芬给药后2周和4周，MoKCs是主要的MDMs (图4G)并且定位在CV附近(图S4J)，表明MDMs和MoKCs逐渐从PV区移动到CV区的空间动力学。
综上所述，这些数据表明，MASH中募集的Ly6Chi单核细胞迅速分化为寿命较短的Clec4e+巨噬细胞，并在第一周内通过发生凋亡死亡，其中一小部分分化为C1qc+巨噬细胞和Spp1+巨噬细胞。然后MoKCs出现，逐渐成为优势细胞群，并定位在CV。
Figure 4. RBPJ regulates developmental trajectory of mac subsets in MASH
Figure S4. RBPJ regulates MDM subsets in MASH liver, related to Figure 4
5.RBPJ信号控制MASH中巨噬细胞亚群在的转录组和功能景观
脂质代谢紊乱、炎症和纤维化都促进于MASH的进展。首先，作者MASH WT和Lyz2CreRbpjfl/fl肝脏中的细胞因子和趋化因子进行了定量。Lyz2CreRbpjfl/fl MASH组促炎细胞因子CCL2和肿瘤坏死因子α (TNF-α)显著降低(图5A)。scRNA-seq数据的基因本体(GO)分析显示，Clec4e+巨噬细胞中最富集的TOP通路与炎症反应、细胞趋化性和凋亡信号通路有关(图5B)。Clec4e+巨噬细胞表达促炎基因和趋化因子，包括Il1b、Tnf、Ccl3和Ccl4 (图5C和S5A;表S3)，可能代表促炎巨噬细胞亚群。作者还证实，与其他巨噬细胞亚群相比，Clec4e+巨噬细胞分泌更高水平的IL-1β和TNF-α (图5D)。比较WT小鼠和Lyz2CreRbpjfl/fl小鼠中的Clec4e+巨噬细胞发现，两组之间促炎基因的整体表达量和表达促炎细胞因子的细胞比例有显著差异(图5E和S5B)。C1qc+巨噬细胞高表达参与MHC蛋白复合物以及抗原加工和递呈途径的基因，而Spp1+巨噬细胞上调参与结合整合素、脂肪酸和脂蛋白颗粒相关途径的基因。MoKCs似乎参与调节细胞外基质(ECM)、补体激活和伤口愈合相关的途径(图5B)。此外，Spp1+巨噬细胞显示高表达脂质相关基因(Trem2、Cd9、Spp1、Gpnmb、Fabp5和Cd36)(图S5C和S5D)，类似于参与肝脏再生和纤维化的脂质相关巨噬细胞(LAMs)。作者还观察到，与WT小鼠相比，Lyz2CreRbpjfl/fl小鼠中所有亚群的Ccl2表达显著降低(图5F)，这与Ly6Chi单核细胞募集缺陷(图S2E)和CCL2细胞因子产生减少(图5A)一致。总之，在缺乏Notch信号蛋白RBPJ的情况下Ly6Chi单核细胞募集减少以及单核细胞向巨噬细胞的转化减弱可能协同降低MASH中促炎细胞因子的表达。
比较WT组和Lyz2CreRbpjfl/fl组时发现，MCDD诱导的疾病的某些方面相似，包括非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)活性评分(NAS)(图5G)以及反应肝损伤的丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、血清白蛋白(ALB)和高密度脂蛋白(HDL)水平(图S5E-S5H)。然而，作者发现Lyz2CreRbpjfl/fl MASH小鼠的肝纤维化程度(图5H)和血清中的低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)水平(图S5I)显著更低，表明纤维化和脂蛋白代谢的紊乱程度较轻。作者还观察到Lyz2CreRbpjfl/flApoe‒/‒小鼠的脂肪变性、小叶炎症和肝脏纤维化没有明显缓解(图5I和5J)，但血清LDL-c显著降低(图S5J)。通过比较部分DEGs，作者还发现此前发现的在KC2中特异性表达的脂质清除受体Cd36在Lyz2CreRbpjfl/fl ND组的总KCs中的表达显著高于WT ND组(图S5K和S5L)。作者进一步证实了Rbpj缺陷KCs表达更高水平的CD36蛋白(图S5M)并摄取更多的细胞外长链脂肪酸(图S5N)。综上所述，这些研究结果表明，单核细胞和巨噬细胞的Rbpj缺失通过阻断促炎Clec4e+巨噬细胞和通过增加Rbpj缺陷KCs的脂肪酸或氧化脂质摄取降低血清LDL-c来减轻炎症，这在MASH期间有助于保护肝脏。
最后，为了确定在人类肝脏中是否也可以鉴定到这些细胞群，作者将小鼠数据与人类肝脏的scRNA-seq数据集(瘦型与肥胖型)进行了整合。在人肝脏中发现了转录组相似的Ly6Chi和Ly6Clo单核细胞、Clec4e+、C1qc+、Spp1+巨噬细胞、MoKCs和ResKCs细胞群(图5K,5L和S5O)。同样，人CLEC4E+巨噬细胞表达促炎基因的水平最高(图5M)。为了评估小鼠和人类不同数据集之间的代谢相似性，作者进行了单细胞代谢分析。每个单核细胞和巨噬细胞亚群中的代谢活性似乎在很大程度上是保守的，甚至在不同的饮食诱导模型或物种中也是如此(图S5P)。这些结果表明，在大多数MASH小鼠模型和人类肝脏中可以鉴定到相似的单核细胞和巨噬细胞亚群，这些亚群表现出高度保守的细胞功能和代谢特征。
Figure 5. RBPJ signaling controls the transcriptomic and functional landscape of macrophage subsets in MASH
Figure S5. RBPJ controls the diverse transcriptomic and functional macrophage subsets in MASH, related to Figure 5
6.缺乏Rbpj可促进Nr4a1依赖的Ly6Clo单核细胞分化并抑制内皮细胞炎症
ScRNA-seq数据还显示，通过Fcgr4+和Spn+表达鉴定的Ly6Clo单核细胞(图S6A)在Lyz2CreRbpjfl/fl MCDD组的肝脏中更丰富(图3D)，流式细胞术验证了这一观察结果(图6A和6B)。这些细胞代表了真正的非经典Ly6Clo巡逻单核细胞而不是过渡态巨噬细胞，因为它们表达典型的非经典Ly6Clo单核细胞基因，如Spn、Ear2、Ace和Nr4a1 (图6C)，并表现出预期的形态(图6D)。活体成像显示Ms4a3CreRbpjfl/flRosaTdT MCDD小鼠的CD43+Tomato+单核细胞位于肝窦腔内，并在内皮周围爬行(图6E和6F)。综上所述，这些数据表明，Rbpj缺失促进了非经典Ly6Clo单核细胞数量的增加。
为了更好地了解Rbpj缺陷Ly6Clo单核细胞的功能特性，作者比较了它们在WT组和Lyz2CreRbpjfl/fl MASH组中的转录组。基因集变异分析(GSVA)分析显示，在Rbpj缺陷Ly6Clo单核细胞中参与纤维蛋白原结合、ECM和单核细胞趋化过程的基因表达下调，而参与整合素和MHCII途径过程的基因表达上调(图6G)。Rbpj缺陷Ly6Clo单核细胞显著表达更高水平的与细胞粘附(Cx3cr1)、迁移(S1pr5和Ccr2)、抗原呈递(Cd74、H2-Aa、H2-Ab1、H2-Eb1和H2-K1)和脂质转运(Cd36)相关的基因(图S6B和S6C)。作者确认了其中一些关键表面分子的表达，包括CCR2、CX3CR1、细胞间粘附分子1 (ICAM1)和ICAM2，并确认了CD43和CD11a在Rbpj缺陷Ly6Clo单核细胞上的表达下调(图6H)。
为了确定介导peri-CV区域Ly6Clo单核细胞‒LSEC粘附的配体，作者在KO组中筛选了ECs中上调的粘附分子。Icam1、Icam2、Itgb1和Stab2的表达在Lyz2CreRbpjfl/fl MCDD组的ECs中较高(图S6D)。然后，作者使用Kit的表达对peri-PV ECs (CD117lo)与peri-CV ECs (CD117hi)进行了分选，结果显示ICAM1和CD29 (Itgb1)的mRNA和蛋白量在peri-CV ECs中更高(图S6E-S6G)。Rbpj敲除未诱导Ly6Chi单核细胞CCR2、CX3CR1、ICAM1或ICAM2表达上调(图S6H)，Lyz2CreRbpjfl/flNr4a1fl/fl组的CCR2、CX3CR1和ICAM1高表达恢复到WT水平(图6I)，表明Rbpj敲除不仅促进了细胞分化，还促进了迁移和粘附标志物在Nr4a1依赖的Ly6Clo单核细胞上的表达。已知巡逻Ly6Clo单核细胞可以维持血管内皮的完整性和稳态并促进组织修复，这些数据表明，ECs上粘附分子的高表达可能介导Rbpj缺陷Ly6Clo单核细胞对肝窦内皮更活跃的巡逻。
发现Cd36的表达升高也是特别有趣的(图S6B)，考虑到之前观察到的CD36在Rbpj缺陷KCs中也整体上调(图S5L)。作者进一步证实，与WT相比，Rbpj缺陷的Ly6Clo单核细胞表达更高水平的CD36 (图S6I)，并表现出更多的细胞外长链脂肪酸摄取(图S6J)。由于Ly6Clo单核细胞通过清除受体CD36感知和响应氧化的脂蛋白发挥功能，Rbpj缺陷Ly6Clo单核细胞的丰度更高及其与LSECs之间更强的亲和力可能进一步增强其增强的脂质摄取能力并保护LSECs免于脂质毒性。
MASH期间会诱导ECs炎症，这进一步加剧了肝脏的炎症。为了评估来自WT和Lyz2CreRbpjfl/fl小鼠的ECs之间的差异，作者分析了编码促炎细胞因子和趋化因子的基因的表达，发现与WT MASH组相比，这些基因在Lyz2CreRbpjfl/fl MASH组 ECs中的表达整体下调(图6J和S6K)。细胞‒细胞相互作用组分析也指出，与WT相比，Lyz2CreRbpjfl/fl中ECs与单核细胞/巨噬细胞亚群之间的细胞因子受体相互作用较弱(图S6L)，表明Lyz2CreRbpjfl/fl ECs中的炎症网络下调(图6J)，这可能有助于限制MASH中的炎症(图5A)。因此，Rbpj敲除通过阻断炎症性MDM转变和促进Ly6Clo单核细胞诱导的内皮保护减轻MASH中的炎症。
Figure 6. Absence of Rbpj promotes the differentiation of Nr4a1-dependent Ly6Clo monocytes and inhibits endothelium inflammation
Figure S6. Absence of Rbpj promotes the differentiation of Ly6Clo monocytes and inhibit endothelium inflammation, related to Figure 6
7.RBPJ抑制可减轻MASH等级
为了探索靶向Notch‒RBPJ信号通路的治疗价值，作者首先使用或不使用RBPJ抑制剂(RIN1)处理MCDD诱导的MASH小鼠(图S7A)。RIN1处理小鼠的肝脏表现出类似的MASLD病理(图S7B)和血清LDL-c水平(图S7C)。然而，RIN1组中的促炎细胞因子CCL2显著降低(图S7D)。在RIN1处理的肝脏中，作者还观察到MDMs和MoKCs略有减少，Ly6Clo单核细胞增加(图S7E和S7F)。
为了评估RIN1在其他饮食诱导的MASH模型中的作用，作者对小鼠喂食WD 22周诱导MASH，然后再利用RIN1处理小鼠(图7A)。RIN1处理具有肝脏保护作用，组织学改变较轻，包括脂肪变性和小叶炎症较少(图7B,7C和S7G)。在WD诱导的MASH中发现了与MCDD模型中相似的单核细胞和巨噬细胞亚群(图S7H)，且其绝对数量在RIN1处理组中减少(图7D)，与作者在Rbpj缺陷小鼠中的观察结果相似。
为了减少药物递送途径的非特异性，纳米颗粒(NPs)装载RIN1和异硫氰酸荧光素(FITC)作为报告物来测量NPs摄取。静脉注射后2小时在Ly6Chi单核细胞、Ly6Clo单核细胞、ResKCs和LSECs中检测到了FITC信号(图S7I和S7J)。NP-RIN1处理2周后，WD诱导的Apoe‒/‒ MASH小鼠的MASH等级降低(图7E-7G)。NP-RIN1组的MoKCs、Clec4e+、C1qc+和Spp1+巨噬细胞显著减少(图7H和S7K)。NP-RIN1处理无副作用，ALT降低(图S7L)，HDL升高(图S7M)，ALB、总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)无其他显著性变化(图S7N和S7O)，提示NP-RIN1处理对肝细胞和脂蛋白代谢具有保护作用。作者对肝脏进行了bulk RNA-seq来揭示Apoe‒/‒、Lyz2CreRbpjfl/flApoe‒/‒和NP-RIN1处理的Apoe‒/‒小鼠的转录组学差异(图S7P和S7Q)。与对照组相比，Lyz2CreRbpjfl/flApoe‒/‒组和NP-RIN1组的促炎和纤维化基因显著下调(图7I和7J)。与WT组相比，包括脂肪酸和类固醇代谢过程在内的途径在Lyz2CreRbpjfl/fl和NP-RIN1组富集(图S7R)。NP-RIN1组显示胆固醇生物合成、转运以及HDL到LDL的通路下调(图7K和7L;表S3)，支持了NP-RIN1处理对肝细胞和脂蛋白代谢具有保护作用的结果。总之，这些治疗模型表明，抑制RBPJ信号传导可以部分模拟之前描述的Lyz2CreRbpjfl/fl小鼠表型并减轻MASH，强调了这些研究结果的治疗相关性。
Figure 7. RBPJ inhibition alleviates MASH grade
Figure S7. RBPJ inhibition reduces severity of MASH, related to Figure 7
总结:1.Notch-RBPJ信号调节肝病中的单核细胞向巨噬细胞转变。
2.Rbpj缺陷减少促炎性巨噬细胞发育。
3.Rbpj缺陷促进具有保护作用的Ly6Clo单核细胞的生成。
4.利用选择性拮抗剂抑制RBPJ可降低MASH的严重性等级。
汇报人：张瑞芬