今天分享的文献是发表于Cell Metabolism期刊，题目为“Metabolic support by macrophages sustains colonic epithelial homeostasis”。

1. 背景介绍

巨噬细胞是非常灵活的细胞，因为不同的激活刺激和环境信号可以强烈地塑造它们的功能特性。有研究者提出了巨噬细胞进化为营养细胞的想法，而这种潜在的代谢支持在肠道中可能特别重要。另外肠道具有很高的细胞更新率，上皮细胞组成性增殖和分化，同时保护自己免受微生物环境的影响。

在这里，作者发现结肠中的巨噬细胞与上皮隐窝细胞密切接触，并使用雷帕霉素复合物 1 （mTORC1） 信号的机制靶标为它们提供代谢支持。mTORC1 激活的巨噬细胞产生被上皮细胞消耗的多胺，这使它们能够重新连接自己的新陈代谢以促进上皮细胞增殖，这种代谢机制在增殖应激阶段（例如炎症诱导的结肠炎）特别重要。

2.实验结果

2.1髓系细胞中 mTORC1 的激活可防止 DSS 诱导的结肠炎

通过分析野生型 （WT） 小鼠的结肠样本，发现 F4/80+ 巨噬细胞与上皮隐窝细胞密切接触。因此作者使用 mTORC1 的负调节因子TSC2干扰了mTORC1 信号传导通路，Tsc2 的失活导致位于 Tsc2 Lyz2-Cre 小鼠上皮隐窝细胞直接相邻的固有层 （LP） 巨噬细胞的大小和数量显着增加（1AB）。接着发现 Tsc2Lyz2-Cre 小鼠在用 2% 和 5% DSS 处理后比 Tsc2fl/fl 小鼠减轻的体重更少（图 1C），在5%浓度DSS致死率显着降低（图 1D），结肠长度显着延长。肠道屏障功能标志物的肠道通透性也得到了更好的改善（图 1F），表明Tsc2Lyz2-Cre小鼠的结肠炎症反应减少。通过对小鼠结肠样本的F4/80和pS6进行了免疫荧光（IF）染色，发现在Tsc2fl/fl 小鼠结肠稳态中，mTORC1在巨噬细胞中基本不活跃，在结肠炎期间F4/80+巨噬细胞中强烈且暂时激活；Tsc2Lyz2-Cre小鼠的70%的结肠巨噬细胞在稳定状态下表现出活跃的mTORC1信号通路（图1G），在DSS诱导的结肠炎中进一步增加，并在结肠炎诱导后11天保持升高。总之，这些数据表明，mTORC1在DSS结肠炎反应中被诱导，并保护其免受肠道损伤。

图1 巨噬细胞中 Tsc2 的缺失可防止 DSS 诱导的结肠炎

2.2巨噬细胞通过 mTORC1 支持上皮细胞增殖

在 Tsc2fl/fl 小鼠中，大约 45% 的结肠在 2% DSS 处理后被完全损伤，而在 Tsc2Lyz2-Cre 小鼠中仅检测到约 10% 的完全损伤（图 2A）。Tsc2Lyz2-Cre 小鼠维持了通常在 DSS 诱导的结肠炎期间丢失的产生粘液的杯状细胞（图 2B 和 S2A）。由于损伤减少，推测巨噬细胞中 mTORC1 的组成型激活，以及 Tsc2Lysz2-Cre 小鼠中 mTORC1 数量的增加，可能会影响上皮细胞的增殖动力学。由免疫荧光和组化图，可知Tsc2Lyz2-Cre 小鼠上皮隐窝细胞的增殖显着增加（图 2C 和 S2B IHC）。反而稳态期间，没有观察到上皮细胞中的 mTORC1 活性（图 S2C）。

在稳态下用 mTORC1 抑制剂依维莫司 （Ev） 处理的 Tsc2 Lyz2-Cre 小鼠中，很大程度上消除了基因型之间的差异。Ev处理减少了巨噬细胞中的 mTORC1 激活，并减少了 Tsc2Lyz2-Cre和Tsc2fl/fl小鼠中的巨噬细胞数量（图 S2E）。在用Ev的Tsc2Lyz2-Cre小鼠中，增殖的增强与平均隐窝长度的减少有关（图2E）。 WT小鼠的 Ev 处理也抑制了上皮细胞增殖并导致隐窝长度增加（图 2F 和 2G）。

为了独立验证巨噬细胞中 Tsc2 的缺失是否促进上皮细胞更新，将 Tsc2fl/fl 小鼠与 CD11c-Cre 小鼠杂交，这些小鼠不仅在树突状细胞中缺失，而且在肠道巨噬细胞中缺失。与 Tsc2Lyz2-Cre 小鼠类似，表达 CD11c 的细胞中 Tsc2 的缺失增加了 F4/80+ 巨噬细胞的数量和大小（图 3A 和 S2F）并增强了上皮细胞增殖（图 3B），而隐窝长度减少（C）。

因此，在表达 Lyz2 或 CD11c 的巨噬细胞中 mTORC1 的过度激活导致上皮细胞增殖增加。为了直接解决 WT 巨噬细胞在稳态期间是否调节上皮细胞增殖，作者用集落刺激因子M279 耗尽结肠巨噬细胞发现同时减少上皮细胞层中的 Ki67 + 细胞（图 3D），从而导致隐窝伸长（图 3E）

总之，这些数据表明结肠巨噬细胞通过 mTORC1 促进上皮细胞增殖。

图2 巨噬细胞通过 mTORC1 促进上皮细胞增殖

2.3巨噬细胞产生 mTORC1 依赖性多胺

作者检测了众所周知影响肠道稳态的不同炎性细胞因子的表达，以及典型的巨噬细胞极化标志物，微生物组组成，发现都没有显著影响。鉴于 mTORC1 是细胞代谢的主要调节因子，并且排除了 mTORC1 重编程巨噬细胞以影响稳态下细胞因子表达，假设 mTORC1 改变了 Tsc2Lyz2-Cre 小鼠结肠中巨噬细胞的代谢，从而产生代谢物，进而刺激上皮细胞增殖。为了检验这一假设，对全结肠标本中的各种氨基酸和 Krebs 循环中间体进行了靶向代谢组学。鉴定 47 种代谢物，其中 11 种在 Tsc2fl/fl 和 Tsc2Lyz2-Cre 小鼠之间显着不同（图 4A）。 KEGG 代谢富集分析发现“亚精胺和精胺生物合成”（Spd 和 Spm）和相关生物合成途径在分析中高度富集（图 4B 和 S3I）。

在单独的实验中证实了 Tsc2 Lyz2-Cre 小鼠结肠中多胺 Spd 和 Spm 及其前体腐胺 （put） 的水平增加，但在 DSS 结肠炎期间没有增加（图 4C）。此外，Tsc2Lyz2-Cre 小鼠的骨髓巨噬细胞 （BMDM） 在 体外产生更多的 Spd 和 Spm（图 4D）。使用雷帕霉素mTORC1 抑制剂，在很大程度上逆转了 Tsc2Lyz2-Cre 细胞中 Spd 和 Spm 表达的增加（图 4D）。多胺含量在转录、转录后和翻译后水平受到高度调节（图 4E）。因此，发现与 Tsc2fl/fl BMDM 相比，许多合成代谢和分解代谢多胺调节基因在 Tsc2Lyz2-Cre BMDM 中表达更高，并且它们对雷帕霉素治疗的反应各不相同（图 4F 和 S3J）。

分选结肠巨噬细胞的转录分析证实，多胺调节基因在 Tsc2Lyz2-Cre 小鼠中受到强烈影响（图 4G）。结肠巨噬细胞在Tsc2Lyz2-Cre小鼠的多胺合成所需的第一限速酶1（Arg1）结肠中表现出更高的Arg1蛋白水平（图4H）。

这些结果表明，巨噬细胞中多胺的产生以Tsc2/mTORC1依赖的方式被刺激。 

图3 表达 CD11c 的巨噬细胞促进上皮细胞更新

2.4髓系多胺生产重新连接上皮细胞以优化增殖

鸟氨酸脱羧酶（ODC1）和腺苷甲硫氨酸脱羧酶（AdoMetDC或AMD1）这些酶提供了代谢中间体鸟氨酸和s-腺苷基蛋氨酸（SAM），它们的抑制剂阻断了WT小鼠的上皮细胞增殖，并减少了LP中的巨噬细胞数量（图5A）。用 2% DSS诱导结肠炎症后，DFMO 在第 11 天降低了 Tsc2Lyz2-Cre 小鼠的上皮细胞增殖（图 S4A）。

为了直接分析巨噬细胞产生的多胺是否支持上皮细胞增殖，采用了 Cx3Cr1 髓特异性 Arg1 缺陷小鼠 （命名为 Arg1Cx3Cr1-Cre）。在稳态下，Arg1Cx3Cr1-Cre 小鼠表现出结肠上皮细胞增殖的强烈减少（图 5B）和隐窝长度延长（图 5C）。此外，结肠中的 put 、 Spd 和 Spm 水平降低 （图 5D）且更容易患 DSS 结肠炎。表现为体重减轻增加、结肠长度减少和糜烂面积增加（图 5E-5G），上皮细胞增殖减少（图 5H）。为了独立确认来自骨髓来源细胞的多胺会影响上皮细胞，使用了 Spd/Spm N（1）-乙酰转移酶 （Sat1，也称为 SSAT） 敲除 （KO） 小鼠。Sat1 是多胺代谢分解代谢途径中的一种限速酶（图 4E）在结肠巨噬细胞和炎性单核细胞中的表达高于小肠的任何其他免疫细胞（S4D）。

  对 WT 小鼠进行致命照射，并使用 Sat1-KO 或 SAT1 WT 骨髓进行移植。接受 Sat1-KO 骨髓的小鼠细胞增殖增强和隐窝长度缩短（图 5I 和 5J）。这些结果表明，巨噬细胞和骨髓细胞中多胺产生的调节会影响结肠中上皮细胞的增殖。

图 4 巨噬细胞产生 mTORC1 依赖性多胺

2.5外部多胺的摄取会重新连接新陈代谢以支持防御和增殖

使用荧光标记的 Spd 和 Spm 在体外很容易被结肠上皮细胞吸收，并且这种摄取可以被多胺转运抑制剂紫精二苄 （BV） 阻断（图 6A 和 S5A）。此外，荧光标记的 Spd 和 Spm 也被离体 和 体内上皮细胞摄取（图 6B 和 6C）。通过 Spd/Spm 的 IF 染色，Tsc2Lyz2-Cre 小鼠上皮细胞中的多胺含量增加（图 S5B）。

为了直接测试多胺是否能促进结肠细胞增殖，用不同量的 Spd 和 Spm 处理了两种结肠细胞系 HCT116 和 Caco-2，发现两种多胺在体外都增强了结肠上皮细胞的增殖（图 6D）。

此外，Spm 而不是 Spd 直接促进了两种独立的人结肠类器官的生长（图 6E、S5C 和 S5D），以及 WT 小鼠 体内上皮细胞的增殖（图 6G）。最后，旨在研究上皮细胞摄取巨噬细胞衍生的多胺的意义。假设外部多胺释放了多胺前体 L-精氨酸和 SAM，用于对肠道增殖和/或宿主防御很重要的其他细胞过程。

因为在表达标记物 CD44 的隐窝基座附近观察到上皮细胞的增殖最高，分离了 EpCAM CD44+高来自 Tsc2 结肠的上皮细胞FL/FL和 Tsc2Lyz2-Cre小鼠 （图 S5E-S5H）并进行 RNA 测序 （RNA-seq）。最后通过转录组学分析和基因特征富集分析 （GSEA） 确定代谢过程（糖酵解、氧化磷酸化和外源性代谢）和 DNA 修复程序是主要富集途径（图 6H 和 6I），这些过程由 L-精氨酸和 SAM 推动。

从 Tsc2fl/fl 和 Tsc2Lyz2-Cre 小鼠中分离了上皮细胞，并立即测量了耗氧量和细胞外酸化作为糖酵解和氧化磷酸化的代表，Tsc2Lyz2-Cre 的结肠上皮细胞显示这些代谢参数的强烈增加（图 6J）将Tsc2fl/fl 和 Tsc2Lyz2-Cre 小鼠置于 DSS 诱导的结肠炎中，并通过 pH2AX 染色测量 DNA 损伤，pH2AX 是指示 DNA 双链断裂的标志物，在 DSS 诱导的结肠炎期间，来自 Tsc2Lyz2-Cre 小鼠的结肠上皮细胞的 DNA 损伤显着减少（图 6K）。相比之下，与对照组相比，Arg1Cx3Cr1-Cre 在 DSS 结肠炎期间上皮细胞中的 DNA 损伤增加（图 S5I）。

最后通过单细胞RNA-seq（scRNA-seq）数据集克罗恩病患者和溃疡性结肠炎，表明巨噬细胞多胺代谢可能影响人类肠道疾病。这些数据表明，结肠上皮细胞吸收了由mtorc1激活的巨噬细胞产生的外部多胺，这些巨噬细胞重新连接其代谢，以增强和保护细胞增殖。   

图 5髓系多胺的产生促进上皮细胞增殖

3. 结论与讨论

巨噬细胞中Tsc2的缺失激活了 mTORC1 信号传导，防止结肠炎诱导的肠道损伤，并诱导多胺亚精胺和精胺的合成。上皮细胞摄取这些多胺并重新连接其细胞代谢以优化增殖和防御。

作者巧妙利用基因敲除小鼠，整合靶向代谢组学及转录组学，体内体外实验相互验证，揭示巨噬细胞代谢共生体的作用，继而影响肠上皮细胞增殖。

                                                                                                                                                                                                                            汇报人：严焕娟