本周汇报的文献是昼夜节律的破坏促进了雄性果蝇中多巴胺能神经元的退化。2023年9月发表在nature communications的一篇文章。
首先简单介绍一下帕金森病，帕金森病（PD） 是一种常见的神经退行性疾病，主要影响运动功能。它的特征是中脑黑质中的多巴胺能神经元逐渐丧失，导致大脑中多巴胺水平下降，从而引起一系列运动症状，如震颤、肌肉僵硬、运动迟缓和姿势不稳。帕金森病的病因与多种因素有关，包括遗传因素和环境压力（如氧化应激），其中氧化应激是导致神经元损伤的主要病理机制之一。PD 患者还可能伴有睡眠障碍、抑郁和认知功能下降等非运动症状。图中箭头展示了多巴胺、GABA、谷氨酸和乙酰胆碱等神经递质的传递路径，这些传递路径的失衡是帕金森病运动症状的原因。
根据这几点：
1、果蝇作为帕金森病和神经退行性疾病研究的模型为后续实验设计提供了模型基础。
2、睡眠和昼夜节律的紊乱可能先于PD的运动症状，并可能促成PD的发生。
3、PD患者多巴胺能神经元逐渐退化。
4、昼夜节律紊乱与PD有密切关系，但昼夜节律紊乱与神经退化之间的因果关系尚不明确。作者提出了以下科学问题，昼夜节律的破坏是否会导致多巴胺能神经元退化。
作者首先通过酪氨酸羟化酶(TH)免疫染色法评估DA亚群神经元的存活情况，酪氨酸羟化酶（TH），这是合成多巴胺的关键酶。在DA的亚群中，在H2O2处理后只有仅在PAM簇中观察到th阳性神经元丢失，可能反映了PAM神经元对氧化应激的高敏感性。然后作者用RedStinger标记了PAM，H2O2处理导致PAM减少，这表明氧化损伤导致PAM神经元数量的损失，而不仅仅是TH表达的减少。所以后续作者把研究重点放在了PAM上。
本实验的昼夜H2O2处理方案是以四小时为一个区间，在不同的ZT将果蝇暴露在H2O2中，并在处理后7天对DA神经元进行分析。果蝇在LD周期下同步3天，确保它们的生物钟与外界光暗循环保持同步，然后在实验的第四天转入DD条件（恒定黑暗）。此时，果蝇的内源性生物钟依然在运行，但不再受到光暗周期的干扰。在DD第四天进行H2O2处理，目的就是研究当没有光暗信号干扰时，PAM神经元的丧失是否仍然表现出昼夜节律性。这可以揭示PAM神经元的氧化应激响应是否受到内源性生物钟调控，而非仅仅是光暗信号的影响。
和control比，H2O2处理在所有时间段都有PAM神经元损失，而在ZT20(就是关灯后8小时)处理导致的PAM神经元损失比其他时间点更为显著。用5%浓度做了，也是一样的结果。外界的光暗周期（LD条件）对PAM神经元的易感性有显著影响，尤其是在夜晚阶段（ZT20）PAM神经元对氧化应激更加脆弱。而第二个实验表明PAM神经元对光调节的氧化应激的脆弱性具有内在的节律易感性。
per和tim基因是控制昼夜节律的关键基因。接下来作者又通过敲除果蝇per基因来探讨PAM神经元的内在节律易感性是否受到昼夜节律生物钟的控制。在正常条件下，日龄1的per0突变果蝇PAM神经元的数量就比正常对照组少，并且随着年龄增长，PAM神经元的丢失更加明显。tim敲除果蝇也表现出类似现象。这些发现表明，昼夜节律生物钟的破坏干扰了PAM神经元的发育，并加速了它们的年龄依赖性退化。并都表现出运动缺陷。
然后再做了氧化应激、per敲除和光照周期作用下PAM数量的变化。发现了2.5% H2O2不影响w1118和Canton-S的PAM神经元，但却能诱导per敲除果蝇的PAM神经退行性变。表明了per敲除果蝇增加了PAM神经元对氧化应激诱导的变性的脆弱性。接下来作者对每只果蝇进行了LD和DD中5% H2O2的昼夜氧化处理，与其他时间点相比，ZT12的处理导致pam神经元的损失更为显著。相比之下，时间点的差异在DD中被消除了。这就说明了per这个生物钟基因控制着PAM神经元对氧化应激敏感性的大小和时间变化。（在per0突变体中，PAM神经元数量的在CT条件下没有节律性变化，这表明per基因对PAM神经元的氧化应激敏感性确实有重要的调控作用。）在缺失了per时，外部光源可以使PAM神经元出现脆弱性的昼夜节律。
PAM自身不含有生物钟，是通过其他含有时钟机制的细胞或系统进行非细胞自主调控的。作者首先又从摄食量的角度思考PAM神经元的丧失是否与果蝇的饮食和饮水模式有关。在LD和DD中，果蝇在喂食对照溶液(水和染料)时表现出有节奏的摄食模式，而10% h2o2溶液的进料规律则不明显，并且摄取量明显低于对照组。由于在不同时间点摄入的H2O2量没有显著差异，因此PAM神经元的昼夜节律性脆弱性并不是由果蝇摄取H2O2溶液的日常摄食模式所引起的。因为实验要求果蝇在H2O2暴露之前和期间挨饿。为了排除饥饿的影响，对照组在5小时饥饿/缺水期后给予4小时饮水。结果表明PAM神经元的丧失及其节律性不是由H2O2处理前或处理过程中的饥饿或脱水引起的。
在排除了系统误差后，作者使用R58E02驱动子在PAM神经元中特异性地表达过氧化氢酶。过氧化氢酶的表达有效地阻止了H2O2诱导的LD和DD中PAM神经元的损失。这些结果表明，暴露于H2O2后，PAM神经元内ROS的升高直接导致PAM神经元的神经变性。
因为先前有研究表明，果蝇和哺乳动物的内源性氧化应激水平每天都在变化。所有作者想看看内源性ROS水平的昼夜节律变化和在特定时间点给予的H2O2处理是否共同作用，使得PAM神经元在一天中的某些时段更容易受到损伤。作者用MitoSOX监测果蝇线粒体ROS水平。LD中PAM神经元的MitoSOX荧光强度在ZT20达到峰值，并且根据上面实验结果可以知道此时PAM神经元对H2O2最脆弱。而在DD的不同时间点之间，没有观察到MitoSOX水平的显著差异。在没有光暗变化的条件下，ROS的波动消失了，但神经元的脆弱性仍然存在。因此，研究者推测，生物钟的其他机制（与ROS波动无关）可能在控制PAM神经元的脆弱性，尽管ROS水平不再随昼夜变化。
为了验证表达PER蛋白的时钟神经元是否直接或间接调节PAM神经元的易感性，作者在神经元蛋白per敲除果蝇中重新表达PER蛋白并检测PAM神经元。作者使用通过使用Clk1982-GAL4（一种泛时钟神经元驱动子），重新在这些突变体的时钟神经元中表达PER蛋白。图A表现了泛时钟神经元中的per基因拯救阻止了因per基因缺失导致的PAM神经元加速的年龄依赖性丧失。从图B可以看出Clk1982>per 还逆转了在 H2O2 处理后per敲除 果蝇中加剧的 PAM 神经元丧失，使其恢复到与 w^1118 果蝇相同的水平。这些结果表明，时钟神经元中PER基因的缺失至少部分导致了per敲除果蝇中PAM神经元的加剧丧失。
为了测试时钟神经元的哪个亚群在PER调控PAM神经元存活中起关键作用作者用了以下驱动子，Pdf-GAL4 只在 PDF阳性神经元（特别是LNvs）中表达基因，具有更强的特异性，主要影响昼夜节律核心神经元。DvPdf-GAL4 覆盖范围更广，除了所有PDF阳性神经元（LNvs），还包括一些CRY阴性LNds 和CRY/ITP阳性LNd，因此它影响的不仅是核心节律神经元，还涉及其他时钟相关神经元。Clk1982-GAL4 是一个泛时钟神经元驱动子，它能够在大多数时钟神经元中驱动基因表达。Clk856-GAL4，因为它覆盖了LPN且异位表达较少，从而能更精准地在所有时钟神经元中重新表达PER蛋白。
先使用Pdf-GAL4和DvPdf-GAL4进行了per敲除果蝇的基因拯救实验。两种拯救基因型在基础条件下均将PAM神经元的数量恢复到了w^1118果蝇的水平。在H₂O₂处理后，两种拯救基因型存活的PAM神经元数量也显著高于仅表达驱动子的对照组。Pdf-GAL4或Clk1982-GAL4进行的PER拯救在对抗H₂O₂时表现出了相似的保护效果，而使用DvPdf-GAL4的保护效果则较为部分。这是由于Pdf-GAL4和DvPdf-GAL4在LNvs中的表达水平不同所致。结果表明，LNvs（小叶神经元）是对PAM神经元存活的关键调控者，因为在这些神经元中通过Pdf-GAL4表达PER可以完全恢复PAM神经元的存活。 另一方面，LNds（背侧小叶神经元）虽然与LNvs一起参与调控，但并非PAM神经元存活的核心调控者。因为Clk1982-GAL4广泛表达于时钟神经元，但不在LPN中表达，且在非时钟细胞中有异位表达。为了更全面和精确地研究时钟神经元对PAM神经元丧失的调控作用，研究者使用了第二种驱动子Clk856-GAL4，因为它覆盖了LPN且异位表达较少，从而能更精准地在所有时钟神经元中重新表达PER蛋白。用Clk1982-GAL4或DvPdf-GAL4拯救的果蝇对H2O2诱导的PAM神经元丢失表现出部分保护作用，而用Clk856-GAL4或Pdf-GAL4拯救的果蝇在两个时间点都对H2O2具有完全抗性。这段实验的结论是pdf阳性LNvs中的PER表达在PAM神经元氧化损伤后的存活调节中起着重要作用。
接下来作者用了trans-Tango43(一种顺行跨突触追踪工具)，以观察哪些神经元与PAM神经元有直接的突触连接，从而了解是否有特定的时钟神经元与PAM神经元发生突触投射。PAM簇最前部的几个神经元被突触后信号标记，表明dvpdf - gal4标记的神经元直接投射到6 - 7个PAM神经元。而使用Pdf-GAL4的trans-Tango试验在pam簇内没有产生任何阳性信号。结论就是部分dvpdf阳性但pdf阴性的细胞（即3个CRY阴性LNds、1个CRY/ITP双阳性LNds和第五小LNv）与PAM神经元突触前连接。
接下来作者对PAM易感亚群做了鉴定。结果发现，R58E02-GAL4 标记的神经元子群最容易受到损伤。接着作者使用更精确的遗传工具（split-GAL4系统）来识别哪些R58E02阳性PAM神经元子群更易受到H₂O₂处理的损伤。作者选取了4条不同的split-GAL4驱动子线：MB312B、MB043B、MB299B 和 MB315C。这些驱动子标记的神经元群体在蘑菇体的不同区域有部分重叠的投射。结果发现，MB315C 标记的神经元投射到蘑菇体的 γ5子域，MB299B 标记的神经元投射到 α1子域，这些区域的神经元在H₂O₂处理后出现了神经元丧失。结论就是PAM γ3、γ5和α1子群对氧化应激尤为敏感，尤其是 PAM α1子群 丢失最为严重。
作者接下来测了mb299b标记神经元是否对氧化应激具有节律性易感性。过氧化氢在ZT8处理导致大约3到4个神经元丢失，而在ZT20处理平均丢失7个神经元。因此，PAM-α1对氧化应激的易感性在LD中表现出节律性。在DD中，在CT4和CT16暴露于H2O2都诱导了mb299b标记的神经元的显著损失，但在时间点之间没有观察到差异。由此作者猜想存在另一个PAM亚群，在DD中表现出节律性易感性。
使用theNeuPrint工具进行视觉检查发现LNds和mb299b神经元的轴突投射之间存在密切联系。而s-LNvs和mb299b神经元的投影没有显示出明显的接触。与用了trans-Tango43观测到的结果一致。结论是lnds的输入以昼夜节律的方式调节mb299b神经元的脆弱性。
接着实验又从钙离子的角度进行了验证。作者使用了 GCaMP7s，这是一种钙离子传感器蛋白，可以在神经元中表达并通过荧光强度反映 Ca²⁺ 水平。他们通过 MB299B 驱动子让 PAM-α1 神经元 表达 GCaMP7s。这些神经元中的Ca2+水平显示出随时间的变化，每天两次达到峰值，大约在CT5和CT17。在 per0 果蝇 中，Ca²⁺ 水平 在各个时间点波动不规律。结论就是，传递至 PAM-α1 神经元的昼夜节律输入有节律性地调节了它们的活动，并且它们的活跃峰值出现在中午前和午夜前。
作者还通过过表达 Kir2.1 来静默 PAM 神经元 的活动，测试是否可以保护神经元免受氧化应激的影响。然而，结果显示 Kir2.1 过表达 导致了神经元发育障碍，并且没有阻止 H₂O₂ 引发的神经元退化。由此得出结论，PAM-α1 神经元的节律性脆弱性并非由神经元活动水平决定。
接下来，作者探讨了pam -α1神经变性对运动和非运动功能的影响。对果蝇进行惊吓诱导的负向地性实验。对照组和实验组之间基本没有差异。表明PAM-α1不参与攀爬行为的控制。
然后作者探讨了PAM-α1 神经元 丢失对果蝇睡眠的影响，特别是在 H₂O₂（过氧化氢）处理 后，神经元退化是否会导致睡眠和活动模式的变化。结果就是，PAM-α1 神经元的退化（通过 H₂O₂ 处理引发的氧化应激）会增加果蝇的睡眠，特别是在夜间，睡眠变得更加巩固（持续时间更长）。这一效应在年龄较大的果蝇中更为显著。尽管睡眠增加，但果蝇的清醒期活动水平没有下降，说明睡眠增加并非由于低活动性所致，而是与 PAM-α1 神经元丧失有关的睡眠调节变化。
最后是多重打击假说（multiple-hit hypothesis）在 帕金森病（PD） 模型中的应用，解释了基因突变与环境因素如何共同导致多巴胺能神经元的退化。多重打击假说 提出，帕金森病（PD） 不是由单一因素引发的，而是由多个风险因素（如基因突变、环境压力、年龄等）相互作用导致的。这一假说表明，单次的外部伤害（如氧化应激）不足以导致全面的神经退化，需要与其他因素共同作用才能引发严重的神经元退化。在 H₂O₂ 处理 后的第 7 天，PAM 神经元 的数量在处理组与对照组之间有显著差异，但在这段时间内并没有发现神经退化加速的现象。也就是说，H₂O₂ 处理导致了 PAM 神经元 的退化，但没有进一步恶化。作者对 H₂O₂ 处理后的 per0 果蝇 进行长期观察，发现果蝇在 H₂O₂ 处理后的第 14 天，PAM 神经元 显著减少，但在此之后，神经元退化速度并没有比未处理的 per0 果蝇更快，到了第 28 天，两组的 PAM 神经元数量 相同。原因就是H₂O₂ 处理是一种短期的氧化应激，它引发了早期的 PAM 神经元 退化。然而，氧化应激的作用通常是急性的，持续时间有限。当 H₂O₂ 的影响减弱后，神经元的退化速度逐渐回到受 per0 突变 控制的基线水平。换句话说，这个pam数量下降并不仅仅是过氧化氢主导的。结论就是，H₂O₂ 处理 单独引发了 PAM 神经元 的退化，但并未加速神经退化过程。per0 基因突变 作为第二次打击，使得 PAM 神经元 的数量进一步减少，并且加剧了果蝇的寿命缩短。这证明了帕金森病模型中的多重打击假说，即遗传突变和环境压力（如氧化应激）共同作用，最终导致严重的神经元退化和早期死亡。
本文的结论是：
1、per0 突变导致果蝇的神经元加速退化，且与 H₂O₂ 处理结合后，引发果蝇的早期死亡；
2、LNd 神经元是 PAM-α1 神经元 的突触前神经元，且PAM神经元展现出 per 基因依赖的 Ca²⁺节律变化；
3、PAM 神经元在调控睡眠中发挥重要作用，但其与运动控制无关；
4、H₂O₂和 per0 突变 的叠加效应显著降低了果蝇的生存率，支持了多重打击假说。
汇报人：翁一健