原文出处：Livingston MJ, Shu S, Fan Y, Li Z, Jiao Q, Yin XM, Venkatachalam MA, Dong Z. Tubular cells produce FGF2 via autophagy after acute kidney injury leading to fibroblast activation and renal fibrosis. Autophagy. 2023 Jan;19(1):256-277.
摘要
急性肾损伤 (AKI) 后，肾小管细胞可能以旁分泌方式刺激成纤维细胞，导致间质纤维化，但旁分泌因子及其在这种情况下的调节仍然难以捉摸。在这里，我们确定了肾小管细胞中巨自噬/自噬依赖性 FGF2（成纤维细胞生长因子 2）的产生。诱导后，FGF2 充当关键的旁分泌因子，激活成纤维细胞进行肾纤维化。在小鼠发生缺血性 AKI 后，自噬激活在肾小管细胞中持续数周。在诱导型肾小管特异性atg7（自噬相关 7）敲除（iRT- atg7-KO) 小鼠，AKI 后诱导的自噬缺陷抑制肾小管细胞中的促纤维化表型并减少纤维化。在主要细胞因子中，iRT- atg7 -KO 小鼠的肾小管自噬缺陷特异性地减少了 FGF2。自噬抑制还减弱了 TGFB1/TGF-β1（转化生长因子，β 1）处理的肾小管细胞中 FGF2 的表达。与旁分泌作用一致，TGFB1 处理的肾小管细胞的培养基刺激肾成纤维细胞，并且这种作用被 FGF2 中和抗体以及fgf2 - 或atg7抑制-肾小管细胞缺失。在人类中，与非 AKI 相比，AKI 后患者的肾活检组织中肾小管细胞的自噬和 FGF2 水平更高，这与肾纤维化显着相关。这些结果表明，AKI 后持续的自噬诱导肾小管细胞的促纤维化表型转化，导致 FGF2 的表达和分泌，从而在适应不良的肾脏修复过程中激活成纤维细胞进行肾纤维化。
研究背景：
急性肾损伤(Acutekidneyinjury, AKI)是一种严重的临床综合征，其特点是肾脏排泄功能迅速丧失，导致肌酐、尿素等含氮废物堆积，水、电解质和酸碱平衡紊乱。其常见原因包括肾缺血再灌注损伤(IRI)、败血症和肾毒素诱发。目前，尚无有效方法可以减轻AKI的肾损伤，每年约有200万人死于AKI。值得注意的是，即使患者在AKI后存活，其发展为慢性肾脏疾病(CKD)和终末期肾脏疾病的风险仍然很高，被认为是导致CKD发生和发展的主要因素。肾脏修复是AKI恢复的关键。众所周知，肾小管细胞损伤是AKI的主要病理特征，AKI损伤后往往会发生小管细胞的再生和修复。正常的肾脏修复是存活的肾小管细胞去分化、迁移和增殖以替代受损的细胞，随后再分化以恢复完整的肾小管结构和功能。然而，对于损伤较严重的肾小管已失去修复功能，进而导致慢性炎症和肾间质纤维化，从而导致AKI进展为CKD。肾脏中多种类型的细胞均参与AKI向CKD的转变。其中，近端肾小管在修复过程中发挥关键作用。有研究表明，近端小管的急性损伤或在肾小管中过表达HAVCR1/KIM-1可诱导向CKD转变。值得注意的是，受损的近端肾小管可能分泌促炎和促纤维化细胞因子诱导肾间质纤维化并进展为CKD。AKI的急性损伤阶段，近端小管细胞会诱导自噬发挥保护作用。AKI恢复过程中，小管细胞自噬被抑制以促进小管的增殖和修复。严格调控细胞自噬可清除死亡细胞、促进抗原提呈、抑制炎症反应等均，有利于肾脏修复。在这项研究中，作者证明缺血性AKI后肾小管细胞的自噬水平升高，促纤维化细胞因子产生增多。这些细胞因子中，自噬特异性诱导成纤维细胞生长因子2 (FGF2)表达。功能上，FGF2是肾小管细胞在肾修复过程中产生的成纤维细胞激活和间质纤维化的关键因子。
研究结果：
结果一：小鼠在缺血性AKI后肾小管细胞不适应肾损伤修复过程进而持续激活自噬
首先作者使用C57BL/6小鼠单侧肾缺血30分钟后再灌注，4周后取材。Masson染色证实损伤后肾脏间质发生纤维化(图. 1A)。并且作者检测到自噬标志物MAP1LC3B/LC3B积累(图1B)。为探究自噬位置、动态和通量，作者使用自噬报告小鼠，这些小鼠表达RFP-GFP- LC3 融合蛋白，在中性pH值的自噬体中同时发出GFP和RFP荧光，但当自噬体进展为酸性pH值的自噬体时GFP信号消失。假手术对照组小鼠肾小管自噬水平较低，GFP-LC3和RFP-LC3较少(图. 1C)。然而，在单侧肾脏IRI后，作者观察到所有时间点的肾小管中自噬体(黄色GFP-LC3 和 RFP-LC3 重叠点)和自噬体(红色仅RFP-LC3点)的形成都明显增加(图. 1C)。定量分析结果显示(图. 1D)，对照小鼠近端小管有6个自噬体，在IRI后第3天增加到28个，1周进一步增加到38个。之后每近端肾小管的自噬体数量略有减少，但在2周后仍保持在30个，4周时仍保持在22个。作者在自噬溶酶体中观察到类似的变化模式(图. 1D)，这表明损伤后肾脏中持续存在肾小管自噬。作者进一步分析了所有自噬囊泡中自噬溶酶体的百分比，以表明自噬通量的速率(图. 1E)。对照小鼠肾小管自噬通量率为37%，肾IRI自噬通量率有所增加，维持在60%以上。综上所述，这些结果表明，在肾脏适应性修复以及肾间质纤维化发展过程中，肾小管细胞的自噬持续激活。
结果二：iRT-atg7基因敲除小鼠的肾小管自噬缺陷可抑制缺血后肾间质纤维化
肾小管细胞自噬抑制或缺乏可使小鼠AKI加重。初始损伤的严重程度会影响后续的肾小管修复，包括间质纤维化的发生。为了明确小管自噬在肾脏修复中的作用，作者通过将Pax8-rtTA±/LC1±鼠与Atg7flox/flox小鼠杂交，产生iRT-atg7-KO小鼠和野生型(iRT-Atg7-WT)幼崽，建立了可诱导的肾小管特异性atg7敲除小鼠模型。在iRT-atg7-KO小鼠中，强力霉素可以激活Pax8-rtTA，特异性地驱动肾小管中Cre(LC1)重组酶的表达。如图2.A所示，在强力霉素诱导的第3天，iRT-atg7-KO肾脏中出现了atg7缺失等位基因(2.2Kb)，但仅在第1周才检测到ATG7蛋白的丢失。与此一致的是，在强力霉素处理1周后，iRT-atg7-KO肾脏中LC3B-I转化为LC3B-II和ATG12-ATG5复合物的形成被显著抑制(图2. A)。作为对照，未接触强力霉素的WT小鼠或iRT-atg7-KO小鼠未出现自噬缺陷(图2. A)。进而作者检测了肾小管自噬缺陷对缺血后肾纤维化的影响。在单侧缺血性AKI后2-4周，WT小鼠广泛存在胶原沉积，或在肾皮质小血管周围形成纤维化灶以及萎缩的肾小管扩张。与WT相比，iRT-Atg7-KO小鼠肾脏的胶原阳性染色较少(图2. B)。统计结果显示，单侧缺血性AKI发生2周后，WT肾脏间质纤维化发生率为10.1%，iRT-atg7-KO小鼠间质纤维化发生率降至6.6%。4周时，WT小鼠间质纤维化率为17.5%，iRT-atg7-KO小鼠间质纤维化率进一步降低至9.9%(图2. C)。与此一致的是，在单侧缺血性AKI后，WT小鼠的细胞外基质(ECM)成分如Fn1、Col1a1和Col4a1在mRNA水平上增加，而在iRT-atg7-KO小鼠中显著减弱(图2. D)。WT小鼠中Acta2/α-SMA的mRNA表达增加表明，成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化在iRT-atg7-KO肾脏中也受到抑制(图2. D)。作者进一步通过免疫染色在蛋白水平检测了这些纤维化标志物的变化。单侧缺血性AKI后，在WT小鼠在整个皮质和外髓质肾间质中发现大量ECM蛋白(图2. E)和ACTA2阳性肌成纤维细胞(图2. F)。同样，与WT相比，iRT-atg7-KO小鼠显示这些纤维化蛋白的小管间质染色明显减少(图2. E、F)。这些结果表明，在缺血后肾脏修复过程中，持续的小管自噬促进了间质纤维化。
结果三：缺血后肾脏修复过程中肾小管自噬促进小管向纤维化表型转化
接下来，作者探究了自噬对修复较差的肾脏中肾小管衰老的影响。WT小鼠缺血后的肾脏修复过程中，CDKN2A/p16被诱导表达，而在iRT-atg7-KO小鼠中，CDKN2A/p16被显著抑制(图3. A)。小管自噬缺陷也抑制了另一个重要的细胞衰老生物标志物SA-GLB1/β-gal的表达，在缺血性AKI发生2周后，将SA-GLB1/β-gal阳性染色区域从WT小鼠的8%减少到iRT-atg7-KO小鼠的4.3%。在整个4周的观察期内，这种现象一直存在(图3.B-C)。丝氨酸磷酸化组蛋白γ-H2AX和Ki67的免疫荧光结果进一步发现，缺血后WT肾脏在多个时间点中均发现衰老的小管细胞(4个或更多的γ-H2AX阳性灶和MKI67阴性灶)增加，在iRT-atg7-KO小鼠中再次减弱(图3.D-E)。除了衰老，一小部分肾小管细胞在缺血后也G2/发生M细胞周期阻滞，如MKI67和丝氨酸10磷酸化组蛋白H3(p-H3)共同染色的肾小管细胞所示(图4. A)。与WT小鼠比较，iRT-atg7-KO小鼠增殖(MKI67+)细胞较少，p-H3阳性细胞较少，p-H3细胞占总增殖细胞(p-H3+/MKI67+)的百分比明显较低(图4. B)，表明G2/M细胞周期阻滞受到抑制。综上所述，这些结果提示，缺血后肾脏中自噬的持续激活可能调节或与其他肾小管反应协同作用，从而促进慢性肾小管病变和向促纤维化表型转化。
结果四：缺血后肾脏修复过程中肾小管持续自噬选择性地诱导FGF2的产生
在修复不良的肾脏中，肾小管细胞可产生并分泌各种细胞因子刺激成纤维细胞发生间质纤维化。因此，作者假设，通过介导表型转化，自噬可能诱导肾小管细胞表达和分泌促纤维化细胞因子，从而驱动缺血后肾修复中的间质纤维化。为了验证这一假说，作者首先探究肾小管自噬缺陷对促纤维化生长因子产生的影响，包括TGFB1、PDGFB、CCN2/CTGF和FGF2。与对照组相比，WT小鼠缺血后肾脏中Fgf2的mRNA增加了4倍，iRT-atg7-KO小鼠的Fgf2的mRNA减少了2.6倍(图5. A)。WB分析进一步显示，单侧缺血性AKI 2周后，WT小鼠肾脏中FGF2蛋白增加8.3倍，iRT-atg7-KO小鼠中减少到3倍。到4周时，iRT-atg7-KO组的FGF2蛋白表达也从WT小鼠的4.6倍下降到1.9倍(图5. B,C)。这些结果表明，在缺血后肾修复过程中，小管细胞自噬对FGF2存在选择性调节。为了进一步表征FGF2在肾脏中的表达和定位，作者进行了免疫组织化学(IHC)染色(图5. D)。在对照肾脏中未检测到FGF2,缺血性AKI后，FGF2在WT肾基底外侧萎缩的小管细胞质中积累，iRT-atg7-KO小鼠中FGF2的小管表达被抑制(图5. D)。值得注意的是，WT小鼠中Fgf2阳性的萎缩小管被间质变宽包围，表明慢性炎症和纤维化。相比之下，iRT-atg7-KO小鼠萎缩小管周围的间质纤维化组织更薄，因为小管中FGF2的表达受到抑制(图5. D)。定量分析表明，缺血性AKI4周后，FGF2阳性染色面积从WT小鼠的4.2%减少到iRT-atg7-KO小鼠的1.8%(图5. E)。此外,自噬报告小鼠的FGF2免疫染色显示，FGF2与自噬体(重叠图像中的白点)部分共定位，但与缺血后肾脏肾小管中的降解自溶酶体几乎没有共定位，表明自噬与FGF2诱导之间存在时空联系(图5. F)。综上所述，这些结果表明AKI后持续的小管自噬可能特异性诱导萎缩肾小管中FGF2的产生，从而促进间质纤维化，以修复不损伤的肾脏。
结果五：TGFB1处理后自噬特异性激活肾近端小管细胞产生和分泌FGF2
为探究肾纤维化中自噬如何调节FGF2，作者建立了TGFB1处理小鼠近端小管(BUMPT)细胞的体外模型。之前的研究表明，TGFB1诱导这些细胞持续激活自噬。与Fgf2不同，TGFB1处理诱导的CCN2/CTGF和PDGFB的mRNA表达是短暂的，在第1天达到峰值，然后逐渐下降。在TGFB1处理的BUMPT细胞中，FGF2、CCN2/CTGF和PDGFB的诱导作用也在蛋白水平上得到了体现。此外，TGFB1处理BUMPT细胞诱导FGF2和CCN2/CTGF的分泌，而PDGFB未见分泌。TGFB1处理第3天检测到FGF2和CCN2/CTGF的强分泌。利用这一体外模型，作者检测了自噬抑制对肾小管生成和分泌这些生长因子的影响。氯-奎因(CQ)或3-甲基腺苷(3-MA)抑制自噬并显著抑制Fgf2的mRNA表达(图6. A)。TGFB1处理后WT细胞Fgf2的表达呈时间依赖性上调，与对照组相比，mRNA表达在第1天增加了74倍，在第2天增加了419倍，在第3天进一步增加到1210倍(图6. B)。Atg7KO小管细胞的自噬缺陷在所有3个时间点显著抑制了Fgf2的mRNA表达，第1变化分别减少到41,2天的118和3天的139(图6B)。与mRNA变化一致，TGFB1诱导WT细胞中FGF2蛋白增加2.5倍，而这种诱导作用在Atg7KO小管细胞中几乎完全减弱(图6.C-D)。相比之下，TGFB1处理也诱导WT小管细胞mRNA和蛋白水平的CCN2/CTGF和PDGFB表达升高，而这些作用在Atg7KO的细胞中基本不受影响。此外，Tgfb1诱导的FGF2分泌在Atg7KO小管细胞中也被阻断。在WT细胞中，TGFB1诱导FGF2分泌增加6倍，而Atg7KO使其分泌量减少到2.7倍(图6.E-F)。ELISA进一步证实，抑制自噬使WT细胞培养基中分泌的FGF2浓度从431pg/ml降低到Atg7KO细胞培养基中的188pg/ml(图6. G)。抑制自噬并没有减少小管细胞CCN2/CTGF的分泌，反而略有增加。总之，以上数据支持了作者的体内研究结果，即持续的自噬可能特异性地激活小管生成和分泌FGF2，从而导致间质纤维化。
结果六：FGF2中和抗体减弱肾小管细胞对成纤维细胞的旁分泌作用
为了检测小管细胞分泌FGF2的能力，作者用TGFB1处理BUMPT细胞2天，然后用新鲜培养基替换，收集条件培养基(CM)培养成纤维细胞。首先通过WB分析证实CM中FGF2分泌增强(图7. A)。用对照细胞(对照CM)收集的CM或Tgfb1处理的BUMPT细胞(TGFB1-CM)收集的CM，在0、5、10和20µg/mlFGF2中和抗体存在下培养NRK-49F成纤维细胞2天。如图7.B所示，与对照CM相比，TGFB1-CM显著促进成纤维细胞增殖，细胞数量和蛋白含量均有所增加。值得注意的是，FGF2中和抗体以剂量依赖性的方式抑制了Tgfb1-CM诱导的成纤维细胞增殖(图7.B)。TGFB1-CM还能诱导NRK-49F成纤维细胞表达ACTA2、FN1和COL1A1，表明发生成纤维细胞到肌成纤维细胞的表型转变(图7. C)。FGF2中和抗体抑制Tgfb1-CM诱导的ACTA2、FN1和COL1A1表达，进一步支持了FGF2在肾成纤维细胞小管旁细胞活化中的作用(图7. C-D)。鉴于自噬特异性调节FGF2小管的产生和分泌(图5和6)，作者进一步确定了小管自噬抑制对成纤维细胞活化的影响。TGFB1处理的WT小管细胞(Atg7 WT TGFB1-CM)的CM诱导NRK-49F成纤维细胞的纤维化变化(增殖和ACTA2、FN1和COL1A1的表达)，而TGFB1处理的Atg7小管细胞(Atg7 TGFB1-CM)的CM则没有(图7. E、F、G)。在Atg7 WT TGFB1-CM中添加FGF2中和抗体再现了Atg7 KO TGFB1-CM对肾成纤维细胞的抑制作用(图7. E、F、G)。以上结果进一步支持自噬介导的FGF2产生在肾小管细胞旁分泌激活成纤维细胞中的作用。
结果七：Fgf2敲低减弱肾小管细胞对成纤维细胞的旁分泌作用
为进一步探究小管细胞在纤维化中的旁分泌功能，我们从WT和FGF2KO小鼠中分离原代近端小管细胞进行TGFB1处理。首先通过WB分析验证TGFB1处理的WT原代小管细胞诱导和分泌FGF2的情况，而这些变化在TGFB1处理的FGF2KO原代小管细胞中不存在(图8. A)。然后，作者从对照或TGFB1处理的原代小管细胞中收集CMs，培养NRK-49F成纤维细胞。与对照CM相比，Fgf2 WT TGFB1-CM诱导成纤维细胞发生了显著的纤维化变化，表现为细胞增殖增加、ECM蛋白产生增强以及向肌成纤维细胞的形态转变。重要的是，所有这些纤维化变化都在Fgf2KO的成纤维细胞中被抑制(图8. B、C、D、E)。综上这些结果表明FGF2是一种由肾小管产生的自噬依赖性细胞因子，通过其对成纤维细胞的旁分泌作用促进适应不良肾脏修复中的间质纤维化。
结果八：AKI患者肾活检组织中小管自噬和FGF2与肾间质纤维化相关
为了在人体中进行验证，作者评估了13名AKI患者和9名对照肾活检组织中的自噬、FGF2及其与间质纤维化的关系。AKI诊断后3个月内收集肾活检组织，Masson染色结果发现与肾脏组织中胶原沉积最少的非AKI患者相比，所有13例AKI后患者均出现不同程度的间质纤维化。在这些患者中，过度的胶原沉积伴有肾小管损伤和萎缩、肾单位丢失和肾小管周围间质增宽(图9. A)。在定量分析中，肾纤维化面积为2.3%在AKI后患者中显著增加至42.8%(图9. B)。采用LC3B免疫荧光法检测自噬情况发现在对照中，LC3B在肾小管中主要表现为均匀的细胞质分布，具有微弱的点状染色，表明肾小管自噬的基础水平较低(图9C)。相比之下，在所有13例AKI后患者的肾活检中，小管LC3B点状染色的数量和强度均增强，表明自噬体和自溶酶体的形成增加(图9. C)。对照组每个肾小管平均有4个LC3B点，在AKI肾活检中显著增加到19个(图9. D)。作者通过原位杂交(ISH)分析这些组织中的FGF2的mRNA表达，结果发现对照组肾脏的肾小管没有或很少显示FGF2点(图9.E)。然而，在AKI组中，FGF2点均出现在肾小管中，或分散或呈微小簇状(图9. E)。值得注意的是，大多数FGF2阳性的肾小管位于纤维化区，被含有大量炎症细胞的间质包围(图9. E)。通过计数，FGF2点的数量从对照组的4个增加到6个(图9. F)。为了进一步确定AKI后患者肾小管自噬、FGF2的mRNA与肾纤维化之间的关系，作者进行了Pearson相关分析，然后进行了简单的线性回归。AKI后患者肾小管中LC3B小点形成与FGF2的mRNA表达显著正相关(图9. G)。此外，这些患者AKI后纤维化的发展也与肾小管LC3B点状形成和FGF2小管表达呈正相关(图9.H-I)。因此，诱导肾小管自噬和FGF2与其说是肾初始损伤的直接后果，不如说是与AKI后适应性修复不良相关的事件。该患者活检分析支持肾细胞自噬和FGF2参与AKI后肾纤维化和疾病进展。
研究结论：
AKI后持续的自噬诱导小管细胞的促纤维化表型转化，导致FGF2的表达和分泌，在不适应的肾脏修复过程中，FGF2激活成纤维细胞导致肾纤维化。
汇报人：陈芳宇