本周为大家介绍一篇2022年发表在Journal of Crohn’s and Colitis的文章，题目为“The histone deacetylase inhibitor belinostat ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis in mice by inhibiting TLR2/MyD88 and HDAC3/ NF-κB p65-mediated neuroinflammation”。文章表明，belinostat 通过抑制 TLR2 介导的 MyD88 依赖性信号通路抑制神经炎症，并通过下调 HDAC3 增加乙酰化 NF-κB p65 水平，从而显著改善实验性自身免疫性脑脊髓炎。与阳性口服药物 DMF（100 mg/kg） 相比，belinostat （30 mg/kg） 治疗在改善体重减轻、临床评分、暂停时间和暂停行为评分方面表现出更好的效果，表明 belinostat 是治疗多发性硬化症的潜在候选者。
【背景介绍】
多发性硬化症（MS）是一种中枢神经系统（CNS）的慢性炎症性脱髓鞘疾病，其病理特征包括炎症、脱髓鞘、轴突丢失和神经胶质增生。作为年轻人（20 至 40 岁）不可逆残疾的主要原因，MS 影响着全球超过 230 万人，但目前尚无治愈 MS 的方法，患者仍需要长期药物治疗。根据目前对 MS 病理生理学的了解，MS 的治疗策略包括免疫调节疗法、抗炎疗法和抗神经退行性变疗法。在过去的 20 年中，与上述治疗策略相对应的几种药物已被批准用于治疗 MS，包括疾病缓解疗法（(interferons, glatiramer acetate, dimethyl fumarate (DMF), teriflunomide, fingolimod, mitoxantrone)）和人源化单克隆抗体（(natalizumab, ofatumumab, ocrelizumab, alemtuzumab, daclizumab）。这些药物显著降低了复发的发生率，然而它们在预防神经轴突损伤和 MS 过渡到进展期的疗效有限。
实验性自身免疫性脑脊髓炎 EAE） 是一种 MS 动物模型，通常用于该疾病的发病机制和治疗研究。它是一种T辅助细胞（Th）细胞介导的自身免疫性疾病模型，其特征是 T 细胞和单核细胞浸润 CNS，导致MS的关键病理特征的近似值：炎症、脱髓鞘、轴突丢失和神经胶质增生。作为 CNS 的常驻先天免疫细胞，小胶质细胞在炎症和免疫反应中起重要作用。小胶质细胞可分为“M1”细胞和“M2”细胞两种主要表型。EAE 研究表明，小胶质细胞通过调节氧化损伤、髓鞘再生和与 T 细胞的相互作用，积极促进疾病进展的发病机制。在 EAE 的早期阶段，小胶质细胞表达M1表型，导致释放促炎细胞因子，包括TNF-α和IL-1β，表达细胞表面标志物 CD16/32 和 CD86 并导致 CNS 组织损伤。然而，在后期，小胶质细胞主要表达M2表型，通过释放抗炎细胞因子（如 IL-10）促进炎症消退，并表达 CD206。M1 和 M2 亚群在体内共存，并在疾病进展过程中在 CNS 和外周淋巴系统中表现出可塑性。因此，抑制 M1 或促进 M2 小胶质细胞的分子干预可能代表未来治疗 MS 的潜在治疗方法。
除了从组蛋白的赖氨酸残基中去除乙酰基外，组蛋白脱乙酰酶（HDAC）还可以修饰非组蛋白从而调节各种细胞过程。HDAC 参与神经退行性疾病、癌症、中风和糖尿病等各种疾病进展和发展过程中的基因表达活性和转录调控。据报道，它们通过调节细胞因子受体、转录因子和细胞内信号分子的功能参与炎症。研究表明，HDAC 的药理学抑制是治疗包括 MS 在内的神经系统疾病的一种很有前途的治疗策略。HDAC 抑制剂 （HDACis） 具有抗炎特性和免疫调节作用，通过调节树突状细胞 （DC）、T 淋巴细胞（如 Th1、Th17 和调节性 T 细胞 （Treg））以及神经胶质细胞的免疫功能，提供对 EAE 的保护。据报道，HDAC抑制剂TSA通过调节神经保护基因和影响自身免疫反应的发展来改善 EAE 小鼠的神经病理学，减少脊髓炎症浸润、脱髓鞘和轴突丢失。Belinostat 是一种 HDAC抑制剂，已用于治疗复发或难治性外周 T 细胞淋巴瘤，并通过调节 HDAC 的酶活性对 I 类和 II 类 HDAC 抑制作用，表现出有效的治疗作用 。抑制 HDAC 诱导乙酰化组蛋白的积累和肿瘤抑制基因表达的增加，从而导致细胞周期进程的中断、血管生成的抑制和细胞凋亡的诱导。据报道，HDAC抑制剂TSA 和SAHA可改善 EAE，然而，belinostat 对自身免疫性疾病（如 MS）的影响及其潜在机制仍不清楚。
【研究思路】
在本研究中，作者评估了 pan-HDACi belinostat 对 EAE 的影响，并检查了 belinostat 对 LPS 刺激的 BV2 小胶质细胞的作用，以表征 belinostat 在 MS 炎症性自身免疫性疾病中的作用和潜在机制。
【实验结果】
1、Belinostat 治疗可缓解小鼠的 EAE 症状。
Belinostat 以剂量依赖性方式改善小鼠 EAE 的疾病进展。与阳性对照 DMF （100 mg/kg） 相比，belinostat （30 mg/kg） 治疗在改善EAE小鼠体重减轻、临床评分、暂停时间和暂停行为评分方面效果更好，而在改善 EAE 小鼠神经运动评分方面二者效果相似。因此，作者选择 30 mg/kg belinostat 进行进一步研究。
2. Belinostat 治疗可减少 EAE 小鼠脊髓的炎症和脱髓鞘
为了评估 belinostat 对 EAE 相关 CNS 病理的影响，从 belinostat 处理的 EAE 和对照小鼠腰脊髓切片进行染色观察。H&E 染色结果显示，与载体治疗相比，belinostat （30 mg/kg） 给药显着减轻了受影响腰脊髓中的炎性细胞浸润。
LFB 染色表明，与对照小鼠相比，EAE 小鼠表现出脊髓的严重脱髓鞘，而 belinostat （30 mg/kg） 的给药显着减弱了脊髓的脱髓鞘。接下来，使用 MBP 作为标志物进一步评估了脊髓髓鞘少突胶质细胞的变化，与对照组相比，EAE 小鼠脊髓中 MBP 细胞的面积减少，而 belinostat 处理的小鼠在脊髓边缘周围表现出更多的髓鞘少突胶质细胞。Iba1 被用作在 EAE 中诱导骨髓反应的单核细胞/巨噬细胞/小胶质细胞的标志物。对照组中 Iba1 细胞广泛均匀地分布在脊髓实质中，在 EAE 小鼠的脊髓中，Iba1 染色区域显著增加，靠近免疫细胞浸润和脱髓鞘的部，。Belinostat （30 mg/kg） 治疗减少了 Iba1 染色区域，表明小胶质细胞活化和/或单核细胞/巨噬细胞浸润减少。EAE小鼠GFAP 染色面积百分比的增加显示脊髓中星形胶质细胞增加，而在 belinostat 处理的小鼠中观察到 GFAP 面积百分比显着降低，表明星形胶质细胞增生减少。
这些数据表明，belinostat 治疗显着减少了受影响脊髓的炎症和脱髓鞘，并且神经炎症的抑制表现为抑制小胶质细胞和星形胶质细胞活化，这是 EAE 神经退行性过程中的关键事件。
3. Belinostat 治疗抑制 EAE 小鼠脊髓中 M1 小胶质细胞极化和促炎细胞因子的产生
为了系统研究 belinostat 对小胶质细胞极化的影响，应用实时 RT-PCR 评估 M1 和 M2 小胶质细胞标志基因的 mRNA 表达。belinostat 处理显著降低 EAE 小鼠脊髓中 M1 型小胶质细胞标志基因 （CD16、CD32 和CD86）的 mRNA 水平。 同时，belinostat 治疗显著降低了 EAE 小鼠脊髓中促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-12、MCP-1）的表达。
4. Belinostat 在体外抑制 M1 小胶质细胞极化并抑制 LPS 诱导的炎性细胞因子释放
由于 belinostat 治疗抑制了 EAE 小鼠脊髓中 M1 小胶质细胞极化和促炎细胞因子的产生，我们进一步研究了 belinostat 是否抑制 M1 小胶质细胞极化并减少促炎细胞因子的产生使用 LPS 刺激的 BV2 小胶质细胞作为炎症的细胞模型。应用实时 RT-PCR 评估 M1 表型小胶质细胞标志物 （CD16、CD32 和 CD86） 和 M2 表型小胶质细胞标志物 （CD206） 的 mRNA 表达，belinostat （0.3 μmol/L） 处理抑制了 M1 小胶质细胞的激活。
接下来，通过 ELISA 和实时 RT-PCR 研究了 belinostat 对 LPS 刺激的 BV2 细胞中促炎细胞因子（包括 TNF-α、IL-6、IL-1β 和 MCP-1）产生的影响，belinostat治疗显著抑制了炎症因子的表达和释放。与 EAE 小鼠的结果一致，belinostat 还抑制了 M1 小胶质细胞极化并抑制了 LPS 诱导的 BV2 小胶质细胞中炎性细胞因子的释放。
5. Belinostat 通过下调 iNOS 表达抑制 LPS 诱导的 BV2 细胞中 NO 的产生
作者研究了 belinostat 是否影响 LPS 刺激的 BV2 小胶质细胞中 NO 的产生。
用 LPS 处理的细胞表现出 NO 产生的显着增加，用 belinostat 预处理以剂量依赖性方式显着抑制 NO 的产生。LPS 处理显着上调了 iNOS 表达，而用 belinostat 预处理导致浓度依赖性抑制。表明除了抑制 M1 小胶质细胞极化和 LPS 诱导的炎性细胞因子释放外，belinostat 还通过下调 LPS 刺激的 BV2 细胞中 iNOS 表达来抑制 NO 的产生。
6. Belinostat 通过抑制 EAE 小鼠脊髓中 TLR2-MyD88 介导的信号通路来改善神经炎症
TLR2 在 MS 发病机制中起关键作用。为了确定 TLR2 信号通路是否参与 belinostat 在 EAE 中的抗神经炎症作用，应用 Western blotting 确定 EAE 小鼠脊髓中 TLR2-MyD88
结果显示 EAE 小鼠脊髓中 TLR2 、 MyD88 、 IRAK4 、 TRAF6 和 IRF5 的表达增加，belinostat（30 mg/kg） 给药显著降低这些蛋白的表达，表明 belinostat 通过抑制 TLR2-MyD88 信号通路改善神经炎症。
此外，采用 Iba-1 和 HDAC3 双重免疫荧光染色鉴定 belinostat 处理后 EAE 小鼠脊髓小胶质细胞中 HDAC3 表达的变化。结果表明，与对照小鼠相比，EAE 小鼠脊髓中小胶质细胞中的 HDAC3 表达显着增加。与 CMC-Na 溶剂对照处理相比，belinostat （30 mg/kg） 处理显著降低了小胶质细胞中 HDAC3 的表达，表明 belinostat 处理后 HDAC3 在小胶质细胞中的表达受到抑制。
【总结】
1. Belinostat 减轻 EAE 小鼠的临床症状和组织病理学 CNS 炎症结果。
2.与 DMF（100 mg/kg） 相比，belinostat（30 mg/kg）在改善 EAE 小鼠的临床症状方面表现出更好的效果。
3. Belinostat 在体外和体内抑制 M1 小胶质细胞的激活和促炎细胞因子的表达。
4. Belinostat 通过 TLR2/MyD88 和 HDAC3/NF-κB p65 信号通路抑制神经炎症。
汇报人：杜学婷