本周分享的文献是2024年8月发布在journal of nanobiotechnology的一篇文章，标题为5-氨基水杨酸从偶氮还原酶反应性聚合物前药中缓释用于长期结肠靶向结肠炎治疗。（IF=10.6）

1、简介

  正常情况下，结肠内壁上皮细胞表面主要带有负电荷。细胞膜上存在许多磷脂分子（如磷脂酰丝氨酸）带有负电荷。此外，结肠黏液层中的糖蛋白（如黏蛋白）也具有负电荷，从而进一步增强了结肠表面的负电荷特性。在炎症或疾病状态下，这种电荷分布可能会发生变化。

  因此，设计了一种两亲性聚合物胶束结构，产生纳米胶束的递送载体，以避免药物过早吸收。这些胶束的表面电荷被设计成带有负电荷，从而增强了对UC的带正电炎症结肠组织的亲和力，并确保优先定位， 5-ASA通过偶氮键偶联，可在结肠环境中被偶氮还原酶特异性切割。聚合物的侧链有策略地阻碍前体药物，减缓其释放，并使其能够控制，延长药物释放。

2.合成与表征

胶束分为三个部分：疏水聚甲基丙烯酸酯骨架、亲水性侧链和偶氮连接的5-ASA前药单元

第一步：以偶氮二异丁腈(AIBN)为引发剂，以聚乙二醇甲基丙烯酸酯(PEGMA, Mn=950gmol-1)和N-boc保护的N-(2-氨基乙基)甲基丙烯酰胺为单体，进行自由基共聚反应

第二步：用HCl裂解boc保护基团，形成阳离子共聚物P2。最后，以NaBH3CN为还原剂，通过伯胺与化合物3以1:2的摩尔比反应，将偶氮连接的5-ASA前药单元共轭到聚合物主链上。

第三步：确定聚合物中5-ASA的负载为11.5%。P3在72h内一致的吸收谱为偶氮键在生理条件下的稳定性提供了证据。

c：P3有效自组装成胶束，平均直径约为13.5 nm, PDI为0.43

d:通过TEM图像进一步验证了胶束的大小

e：在室温下PBS中保存72小时后，尺寸没有明显变化。值得注意的是，与小分子5-ASA(可快速清除)相比，大尺寸的胶束有望确保在发炎的结肠中长时间保留

f：临界胶束浓度(CMC)为0.59µM

g：在胶束中加入阴离子偶氮前药单元使前体P2的zeta电位从+19 mV变为- 24.2 mV。这种表面的负电荷可以减少健康结肠的粘连，因为黏液层也携带负电荷。

3.体外释放

A：将化合物3(100µM)与还原剂二亚硫酸钠(SDT)在双蒸馏水中孵育。当SDT浓度为2.5 mM时，在室温下孵育30分钟后，4.2 min时的峰消失，同时在1.1分钟处形成了一个新峰，对应于5-ASA，表明偶氮键被还原后释放了5-ASA。

 B：高分子前药P3也有类似的释放行为。不同当量的SDT在双蒸馏水中处理0.5 h后，370 nm处的原始吸收峰下降

S2：0.5 h后在m/z 152.1处出现一个峰，证实5-ASA释放。在模拟胃液(SGF)和模拟肠液(SIF)中，P3胶束保持完整，MS在3小时内未检测到5-ASA

 C：动态光散射（DLS）测量结果与分光光度法和质谱数据一致，P3胶束在SGF中孵育24小时后平均直径保持在约12纳米，而在SIF中则为10纳米。相比之下，在含有25当量SDT的SIF中，胶束尺寸在前4小时内迅速下降至5纳米。

 D，g：首先将P3和SSZ分别在胃内容物中孵育4小时，再在小肠内容物中孵育12小时，这代表了小鼠体内的典型最大转运时间。HPLC分析结果表明，在胃和小肠环境下，P3表现出良好的稳定性，未检测到5-ASA的释放。相比之下，SSZ在胃内容物中未释放5-ASA，但在小肠环境下部分释放了约25%的5-ASA，这种释放行为可能会降低其潜在的治疗效果

 E，h：P3暴露于结肠内容物中时，由于肠道内存在偶氮还原酶活性，触发了5-ASA的选择性释放。HPLC定量分析显示，在24小时的孵育期内，P3实现了控制和持续的释放，约60%的5-ASA以稳定的速率释放。相比之下，SSZ在结肠内的释放模式明显不同，大部分5-ASA（82.9%）在2小时内迅速释放，随后几乎没有进一步释放。P3的持续释放模式保证了结肠炎症组织中长时间维持有效的5-ASA浓度，表明这一新型药物递送系统在优化溃疡性结肠炎治疗方面具有潜力，克服了传统小分子药物如SSZ的局限性。

4.结肠内滞留

S5：利用Caco-2细胞和RAW 264.7巨噬细胞，用CCK-8法评估细胞活力体外评估P2和P3的毒性

B：然后与tritc标记的P3 (TP3，吸收和发射光谱如图S6所示)纳米颗粒(1mg mL−1)孵育。

荧光显微镜显示纳米颗粒粘附最小，粘蛋白层稀疏覆盖，当用阳离子聚醚酰亚胺(1 mg/l−1)处理粘蛋白涂层时，TP3纳米粒子的粘附密度显著增加。

C-e：P3和小分子染料Nile Blue（NB）的体内评估通过对健康和DSS诱导的结肠炎小鼠进行全身荧光成像来评估其滞留模式。由于偶氮化合物的荧光猝灭效应，TP3不适用于全身成像，因此使用了近红外BODIPY（NBP）封装在P3胶束中进行追踪。研究从口服灌胃后立即开始，在0.5、3、6、12和24小时进行跟踪。

NB:12小时时间点的测量揭示了一个独特的结果:NB荧光在健康和dss诱导的结肠炎小鼠中仍然无法检测到，这表明系统完全清除。

NBP@P3:0.5小时时，NBP@P3和NB在上腹部显示出明显的荧光信号；到3小时，DSS小鼠中NB荧光迅速减少，而健康小鼠的信号减弱较为缓和。

F-G:与nb处理的小鼠相比，在3小时标记时荧光信号主要定位于肝脏， NBP@P3表现出完全不同的分布特征。值得注意的是，NBP@ P3在心脏、肝脏、脾脏和肾脏等关键器官中的荧光可以忽略不计

5.治疗效果

在小鼠的饮用水中添加2.5% DSS，连续7天诱导结肠炎症(图4a)。然后每天口服PBS、5-ASA 、P2、P2 + 5-ASA或等效5-ASA剂量的P3，连续7天。在7天的治疗期内，体重增加，DAI指数降低。结肠长度恢复正常，脾脏体重比降低，炎症因子降低。

6.组织学分析

HE染色：DSS的小鼠显示上皮结构广泛破坏，杯状细胞大量丢失，粘膜下水肿，包括中性粒细胞和巨噬细胞在内的免疫细胞大量浸润。

接受5-ASA治疗的DSS小鼠在组织完整性方面表现出中度改善，存在一些残留的杯状细胞丢失和免疫细胞浸润。P2+5-ASA联合治疗导致中等程度的结构损伤和炎症。相比之下，与健康对照组相比，P3处理的小鼠显示出非常完整的结肠形态，具有完整的上皮屏障，丰富的杯状细胞和最小的免疫细胞浸润。P3治疗有效地保留了结肠上皮结构，抑制了炎症，与标准5-ASA治疗相比，其治疗效果显著。

免疫荧光染色：未经治疗的结肠炎小鼠表现出严重的染色破坏和上皮细胞之间的间隙，表明屏障功能丧失。值得注意的是，接受P3治疗的小鼠显示出与健康对照相匹配的紧密连接蛋白表达、组织和定位谱的显著恢复。

7.生物相容性

肝细胞、脾细胞、肺泡、肾小管等均完好无损，无坏死或凋亡。

8.总结

这些前体药物自组装成小的胶束纳米颗粒，具有以下几个优点:

(1)在胶束电晕中结合酶可切割的5-ASA前体药物单元，可以在发炎的结肠部位特异性释放药物，同时避免全身暴露。

(2)胶束的形成和带负电荷的表面促进了对病变粘膜的粘附增强。

(3)此外，聚合物设计的结构允许释放动力学的控制调制。

                                                                 汇报人：江宇豪