本周分享的文献由Sarah A Teichmann等人于2020年2月发表在 Nature Immunology 上，题为 “Distinct microbial and immune niches of the human colon”。本研究利用单细胞转录组测序深入探究了肠系膜淋巴结（mesenteric lymph nodes，MLNs）及结肠不同部位免疫细胞的多样性与结肠微生物群之间的稳态关系，全面揭示了人结肠近端到远端不同区域免疫细胞的比例和激活状态的差异。

肠道内不同部位营养物质和氧气的获得程度、管腔内容物的转运速率和区域化的宿主免疫活性决定了微生物群在空间上的组成具有多样性；肠道菌群以厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门和放线菌门为主, 从食道到结肠呈递增趋势，结肠内的菌群密度最高。研究表明在结肠内从近端（包括盲肠、升结肠和横结肠）到远端区域（包括降结肠和乙状结肠，连接到直肠）的细菌多样性逐渐增加。目前，尚未研究个体肠道黏膜微生物群在区域上的差异，以及这种差异如何影响结肠局部免疫细胞群落。以下是本研究的主要结论。

1、不同的结肠区域微生物组成不同

       本研究取12名健康捐赠者盲肠、横结肠和乙状结肠粘膜表面的拭子进行了16S rRNA测序，绘制结肠粘膜表面的细菌组成图 (1a)。结果显示，每个样本的肠道遍布着肠道菌门类杆菌、厚壁菌、变形菌和放线菌(1b)。在微生物组成上，肠球菌在近端结肠中更为普遍，而类杆菌、大肠杆菌和志贺菌在远端结肠中更为丰富(1c)。

图1  从近端到远端结肠的微生物组变化

2、稳定状态下结肠内的免疫细胞异质性

  为确定结肠微生物的异质性是否伴随着宿主免疫细胞的差异，作者从5名捐赠者的肠系膜淋巴结（mLN）和盲肠、横结肠和乙状结肠的固有膜中分离出免疫细胞进行测序，降维聚类分析后得到25种细胞类型，其中MLNs和结肠组织存在不同的细胞类型（2a）。进行细胞比例分析发现，T和B细胞在结肠和淋巴结之间的激活和记忆状态存在显著差异（2c+d）。 TH17 和 TH1 细胞在结肠中的相对比例呈倒梯度，TH17 细胞从盲肠到乙状结肠频率逐步降低，而 TH1 细胞则相反，在乙状结肠中更为丰富（2c）。结肠 TH1 和TH17 细胞的这种不同分布与微生物组的空间变化一致，暗示了这两个群体之间的关系。

图2  沿稳态结肠分析免疫细胞

3、T辅助细胞在结肠内广泛分布，并具有特定区域的转录特征

    不同结肠组织间的TH1和TH17细胞的相关性分析表明，不同结肠组织CD4+效应T细胞亚型之间具有转录相似性，而MLNs与周围组织的差异则较大（3a）。差异基因表达分析显示，近端结肠中TANK分子高表达，而乙状结肠中KLF2高表达（编码一种转录因子，能激活Sphingosine-1-phosphate receptor 1（S1PR1）的启动子，对于T细胞通过外周淋巴组织循环至关重要）（3b）。

图3  T辅助细胞在结肠和区域中的播散转录谱

作者研究了T辅助细胞的克隆关系，对TCR序列进行分析，观察到乙状结肠中的TH1细胞和盲肠中的TH17细胞克隆扩增最多（3d），同时发现，TH1和TH17部分克隆之间克隆位点共享。这表明辅助性T细胞克隆传播到结肠的远端区域。 结果表明，在近端结肠和乙状结肠的TH1和TH17细胞中，与激活和组织迁移相关的区域特异性转录具有差异性。

4、结肠CD4 T调节细胞的激活轨迹

由于T调节细胞在平衡其他CD4+ T细胞亚群的免疫活动中发挥重要作用，于是调查不同区域T reg细胞的转录是否具有不同的激活状态或功能。结果发现MLNs中的Treg细胞亚群主要为中央Treg细胞和效应Treg细胞，而结肠中Treg细胞主要聚集成三个群：KLRB1+ Treg、非淋巴组织Treg细胞、淋巴组织样Treg细胞（4a），这些亚群的比例在结肠区域之间基本一致（4b）。T-like细胞代表一群暂时失去FOXP3表达的T细胞。

作者推测，淋巴组织样Treg细胞可能从MLNs进入结肠组织的。作者利用拟时序分析探究Treg细胞的迁移轨迹，结果发现Treg细胞沿MLNs中静息态的中央Treg细胞到结肠中具有高度调节性Treg细胞的轨迹排列（4c）。同时对该迁移轨迹中的Treg细胞基因表达变化进行分析，发现拟时序开始时表达的基因包括SELL、CCR7和CXCR4，在拟时序末端，高表达基因为FOXP3、IL2RA、CTLA4、IL10和LAG3（4c）。

图4  Treg从淋巴到外周的活化途径 组织

5、B细胞呈现出由近端至远端的结肠激活梯度

作者比较了不同结肠区域浆细胞的转录谱，观察到CCL3和CCL4在盲肠浆细胞中富集，这些基因由B细胞在BCR激活后表达，导致CCR5表达细胞（如T细胞和单核细胞）向组织微环境迁移，表明BCR交联和信号传导在近端结肠可能更为显著。此外浆细胞中CD27的表达从结肠的近端到远端逐渐增加。

作者对BCR序列进行分析，发现MLNs中记忆细胞表达IgA1和IgM，结肠浆细胞主要表达IgA2（5c）。此外，重链可变区突变频率在浆细胞中最高，其次是记忆B细胞（5c+d）。此外与其他区域相比， IgG浆细胞在乙状结肠中的突变频率显著增加（图5e）

图5  B细胞在乙状结肠中更丰富，克隆扩增和突变 结肠

作者还对克隆相关B细胞进行鉴定来探索整个肠道不同细胞群的克隆扩增动态，发现在记忆B细胞、IgA+和IgG+浆细胞中均观察到了克隆扩增（图5f）。类似于T细胞，作者发现许多B细胞克隆在所有三个结肠区域之间共享（5g），这表明B细胞在结肠中传播。BCR测序结果显示，与盲肠和横结肠相比，乙状结肠B细胞的克隆多样性更高，这反映在BCR可变链表达的更大范围上（补充图5d），这表明远端结肠的反应更为活跃。

    6、IgA 对乙状结肠中更丰富的微生物群落有反应

        IgA（免疫球蛋白A）是由浆细胞在特定细菌种类的存在下分泌的，为验证在乙状结肠中浆细胞激活是否与细菌种类差异有关，作者评估了供体微生物群落中细菌的IgA抗原情况（6a）。 发现与盲肠和横结肠相比，乙状结肠的细菌有更多的IgA结合（图6b）。此外与盲肠相比，乙状结肠中细菌种群更丰富（图6c），但其IgA 结合细菌的多样性（即每个物种的相对丰度）较低。 这些数据表明与盲肠相比，乙状结肠的IgA+浆细胞对丰富且不均匀的细菌群落有反应，这可能是它们的激活状态增加、强归巢到结肠并趋向于更多克隆多样性的原因。（补图6）