本周分享的文献是2021年发表于Gut杂志，题为“Prostaglandin E2 receptor PTGER4- expressing macrophages promote intestinal epithelial barrier regeneration upon inflammation”的文章，作者验证了表达PGE2受体PTGER4的巨噬细胞在促进炎症后肠上皮屏障再生的重要性。
PGE2是一类经由花生四烯酸代谢合成的二十碳不饱和脂肪酸，是环加氧酶(COX)的下游脂质介质。PGE2可诱导宫颈成熟和分娩，介导缓激肽诱导的血管舒张，调节腺苷酸环化酶，是促进多种组织再生的候选分子。PGE2具有4个受体亚型，已有研究表明，不同的亚型受体参与不同的信号通路调控。
肠道巨噬细胞在肠炎消退过程中至关重要，一些研究表明，选择性活化巨噬细胞的存在是重建上皮屏障的关键，因为它们能够分泌几种促进粘膜愈合的生长因子，并将必要的再生信号传递给肠道干细胞。研究表明PGE2对免疫系统具有混合效应，但巨噬细胞PGE2在肠道伤口愈合的具体作用尚不清楚。在这项研究中，作者假设PGE2可能促进肠道巨噬细胞的伤口愈合能力，从而导致肠道炎症的消退。
一、PTGER4在CD206+肠巨噬细胞中特异性表达
GEO数据库分析显示，与健康个体相比，CD和UC患者在结肠活检中PTGER4表达降低。相反，缓解期UC患者的结肠活检恢复了PTGER4表达。对PTGER4在肠道中的细胞进行定位，发现在健康小鼠结肠黏膜中，PTGER4与Csf1r +细胞共定位，大多数PTGER4+细胞表现为巨噬细胞样形态分布在整个固有层和上皮隐窝附近。通过流式细胞术分析了健康小鼠结肠中单核细胞(P1)向中间(P2)和成熟巨噬细胞(P3)分化过程中PTGER4的表达。不同类型免疫细胞中成熟巨噬细胞表达PTGER4的水平最高。
与小鼠数据一致，健康个体结肠粘膜CD68+巨噬细胞中PTGER4高表达，与CD206呈正相关。相比之下，活动性IBD患者中PTGER4+CD206+巨噬细胞的百分比与健康个体相比减少，IBD缓解期患者中PTGER4+CD206+巨噬细胞的百分比恢复。健康人结肠活检的流式细胞术分析证实PTGER4主要由CD206+巨噬细胞表达，而UC活动性患者粘膜PTGER4+CD206+巨噬细胞减少。
综上，PTGER4在CD206+肠巨噬细胞中特异性表达，在患病时相对减少。
图 1 PTGER4在CD206+肠巨噬细胞中特异性表达
二、巨噬细胞PTGER4缺乏不利于肠道炎症期间的粘膜修复
为了评估髓系PTGER4在肠道炎症中的作用，用DSS诱导WT和Csf1r-Ptger4-/-产生结肠炎，检测了诱导期间以及结肠炎恢复期间的生理指标和组织状态，发现WT小鼠的结肠炎症恢复情况较缺陷小鼠好；当没有结肠炎症时，不论是否Ptger4-/-，相关指标都没有显著性变化。
移转WT来源的肠道巨噬细胞，树突状细胞和中性粒细胞，导入Csf1r-Ptger4-/-小鼠，结果表明转移了WT巨噬细胞患有结肠炎的缺陷小鼠结肠恢复情况更好。另外为了检测这些巨噬细胞是否来源于血液单核细胞，作者通过骨髓嵌合体转移实验，即将来自不同基因型表达CD45.2的小鼠的髓系移植到经照射破坏免疫系统的CD45.1小鼠，并诱导DSS结肠炎。与WT小鼠相比，接受Ptger4-/-以及Ccr2−/−细胞的小鼠结肠较短，证明了巨噬细胞表达PTGER4 对结肠炎的组织保护至关重要。
图 2 巨噬细胞PTGER4缺乏不利于肠道炎症期间的粘膜修复
三、PTGER4+巨噬细胞调节肠隐窝再生和上皮细胞增殖对炎症损伤的影响
为了研究Csf1r-Ptger4-/-小鼠在肠道炎症期间的上皮缺陷情况，作者量化了7和21dpt的隐窝数。在21dpt时，Csf1r-Ptger4-/-小鼠的隐窝数量明显低于WT小鼠。此外，对结肠上皮细胞增值相关的marker，如LGR5免疫荧光，流式细胞和免疫组化ki67分析，显示在缺乏髓源性Ptger4的情况下，上皮屏障的恢复存在缺陷。
综上表明，PTGER4+巨噬细胞是修复受损隐窝和促进上皮细胞增殖所必需的。
图3 PTGER4+巨噬细胞调节肠隐窝再生和上皮细胞增殖对炎症损伤的影响
四、PTGER4信号通路促进结肠巨噬细胞的创面愈合表型表达
在DSS结肠炎过程中，巨噬细胞中PTGER4表达缺失对WT和Csf1r-PTGER4−/−小鼠结肠黏膜巨噬细胞总数的绝对数量没有影响。但表达CD206+、ARG1+和RETNLA+的巨噬细胞在Csf1r-Ptger4−/−小鼠40 dpt中特异性减少。正如人类结肠活检所示，在小鼠结肠巨噬细胞中检测到PTGER4和CD206之间存在很强的正相关。虽然不完全代表肠道巨噬细胞，但BMDMs也需要表达PTGER4来诱导CD206、ARG1和RETNLA等选择性活化巨噬细胞特有的基因。这些结果证明了PTGER4参与诱导肠炎症再生阶段伤口愈合巨噬细胞的表达。
为了确定PTGER4+巨噬细胞再生的机制，通过对0和40dpt时分选结肠WT和PTGER4−/−巨噬细胞进行RNA-seq比较。在Ptger4−/−巨噬细胞中与伤口愈合，免疫应答相关基因较WT下降。
这些结果表明，PTGER4的表达能够维持巨噬细胞表达伤口愈合相关基因。
图 4 PTGER4信号通路促进结肠巨噬细胞的创面愈合表型表达
五、PTGER4+巨噬细胞分泌CXCL1对肠上皮细胞增殖至关重要
为了研究来自PTGER4+巨噬细胞的可溶性因子是否会刺激上皮修复，给予Csf1r-PTGER4-/-小鼠注射WT固有层单个核细胞(LPMC)培养上清。这导致Csf1r-Ptger4−/−小鼠40 dpt的结肠长度增加，表明巨噬细胞分泌因子可能影响肠道炎症的消退。基于RNA测序分析，CXCL1是巨噬细胞中受PTGER4缺乏高度影响的差异表达基因之一，并且巨噬细胞是结肠粘膜中负责CXCL1表达的主要细胞群。
为了进一步证实巨噬细胞CXCL1是控制上皮再生的来源因子，沉默骨髓细胞CXCL1生成CXCL1−/−BMDMs，并和野生型小鼠的BMDMs腹腔注射于Csf1r-Ptger4-/-小鼠中，正常情况下能够挽救结肠缩短，而注射Cxcl1-/-BMDMs则没有保护作用。
使用共聚焦IF发现CXCL1与WT小鼠40 dpt F4/80+结肠固有层中巨噬细胞共表达，而Csf1r- Ptger4−/−小鼠几乎没有任何CXCL1表达。这些数据表明，在PTGER4信号的控制下，F4/80+巨噬细胞是结肠炎消退期CXCL1的主要产生者。
为了评估巨噬细胞来源的CXCL1对上皮细胞的影响，用CXCL1处理小鼠肠道类器官发现隐窝出芽效率和Ki67+细胞在隐窝中的比例增加。接下来，作者用LPMC培养上清液处理再生的隐窝，与从Csf1r-Ptger4-/-小鼠中获得的隐窝相比，WT LPMC上清液共培养的隐窝出芽效率更高。在WT LPMC的上清液中加入CXCL1的中和抗体，使出芽效率恢复到Csf1r-Ptger4-/-样品的水平。
总的来说，这些发现表明PTGER4+巨噬细胞以CXCL1依赖的方式刺激上皮细胞增殖。
图 5 PTGER4+巨噬细胞以CXCL1依赖的方式刺激上皮细胞增殖
六、巨噬细胞通过PGE2/PTGER4/MAPKs信号通路释放CXCL1
为了确定PTGER4+巨噬细胞产生CXCL1的确切分子机制，首先检测了PGE2刺激后WT BMDMs中CXCL1的转录，发现CXCL1水平增加了30倍。由图6B可知这主要是由PTGER4介导的。为了检验体内PGE2和CXCL1之间可能的相关性，分别分析了DSS结肠炎期间小鼠的血液和结肠裂解物中PGE2的水平，在WT和Csf1r-Ptger4-/-，PGE2在急性炎症期略有下降，而在恢复期高于稳态水平，与WT小鼠相比，Csf1r-Ptger4-/-小鼠40 dpt的血液和结肠裂解物中CXCL1的水平较低。在恢复期的最后10天，通过给药吲哚美辛阻断内源性COX活性间接减少PGE2产生也会导致结肠长度和结肠裂解物中CXCL1水平的减少。
为了阐明PTGER4+巨噬细胞控制CXCL1产生的机制，将BMDMs与PGE2调节的不同途径的化学激活剂或抑制剂一起预孵育。腺苷酸环化酶激活剂Forskolin不会增加CXCL1，这表明细胞内cAMP积累不会介导巨噬细胞中CXCL1的产生。用H89或表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂埃洛替尼抑制PTGER4主要下游信号分子PKA，并不会抑制PGE2刺激的巨噬细胞产生CXCL1，这表明在PGE2激活的巨噬细胞中，除了PTGER4/cAMP/PKA或EGF信号外，还有其他信号通路参与了CXCL1的上调。另一方面，通过抑制ERK 、p38和JNK来抑制MAPK信号通路可显著降低PGE2激活的巨噬细胞中CXCL1的产生。最后发现使用PTGER1和PTGER3信号激动剂和拮抗剂对CXCL1的产生没有影响。
这表明，PGE2-PTGER4轴激活巨噬细胞中的MAPKs并促进CXCL1的合成，而不依赖于PKA、PKC和EGFR信号。
图 6 巨噬细胞通过PGE2/PTGER4/MAPKs信号通路释放CXCL1
七、脂质体介导的巨噬细胞mapk激活促进ptger4缺陷小鼠肠上皮修复
为了测试激活巨噬细胞中的MAPK- CXCL1通路是否能刺激肠道修复，使用p38 MAPK激活因子asiatic acid (AA)。AA处理增加了BMDMs中CXCL1的产生，而p38抑制剂的预孵育消除了这一现象。
接下来，研究AA对WT小鼠的治疗潜力。与载药组相比，AA组小鼠结肠长度显著增加35 dpt。对Csf1r-Ptger4-/-小鼠注射FNR偶联的含AA-脂质体，对其靶向性进行检测，发现其主要分布在结肠固有层F4/80+，CD206+或CD206−肠巨噬细胞中。另外接受AA-脂质体的Csf1r-Ptger4-/-小鼠的结肠明显更长，并且上皮细胞增殖增加和F4/80+巨噬细胞CXCL1表达增加有关。
以上可以证明巨噬细胞靶向药物传递系统增强MAPK信号可能代表一种潜在的新的治疗策略，以促进肠道炎症的粘膜愈合。
图 7 脂质体介导的巨噬细胞mapk激活促进ptger4缺陷小鼠肠上皮修复
总结：
PTGER4在成熟的肠巨噬细胞上表达，而在小鼠和人炎症粘膜中表达减少，Csf1r- iCre Ptger4fl/fl小鼠在DSS结肠炎模型中表现出粘膜愈合和上皮屏障再生缺陷。在结肠炎期间，巨噬细胞中的PGE2/PTGER4+通过MAPK途径诱导CXCL1的产生，驱动再生隐窝上皮细胞分化和增殖。
汇报人：严焕娟