本周分享的文献是 2023年3月发表在国际杂志Journal of Hepatology题为“Single-cell atlas of the liver myeloid compartment before and after cure of chronic viral hepatitis”的文章。研究人员利用scRNA-seq技术和肝脏FNA，全面解剖了DAA治疗前后HCV慢性患者的肝脏髓系细胞的转录组学景观，发现了肝髓系细胞的亚群，并确定了与治愈感染相关的分子特征。进一步纵向研究了与肝病毒清除相关的免疫激活标志物的血清动力学。展示了人体对可治愈的慢性感染的体内反应图谱，揭示了肝免疫的原理。
背景：慢性病毒感染(丙型、乙型肝炎病毒)是由于宿主免疫系统无法清除病毒所致,特征是持续和异常的免疫激活。直接作用抗病毒药物(DAAs)是临床唯一的治疗手段。该疗法主要靶向并抑制关键的HCV生命周期蛋白。但目前对治疗前后免疫图谱的变化尚不清楚。有大量文章报道，在慢性感染期间，骨髓细胞是对病原体的第一反应者，是先天免疫系统的关键成分，也是适应性免疫和组织修复的调节因子。因此，本文针对DAA治疗前后患者进行深入研究，探讨其髓系细胞亚群的变化。
1.A landscape of intrahepatic myeloid cells defined by scRNA-seq
作者收集23名患HCV的患者进行为期12周的DAAs治疗，使其HCV的核酸水平降至正常范围后，随访24周。并将其中的18名患者的肝脏组织以及7名患者外周血单个核细胞用于单细胞测序。此外，还通过ELISA检测关键免疫激活标志物的含量。基于Smart-seq2测序(全长转录本，高精度高覆盖率，基于孔板)，根据marker gene获得了肝脏中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、常规树突状细胞、浆细胞样树突状细胞、经典单核细胞、非经典单核细胞和巨噬细胞。按照细胞聚类，病人样本，治疗前后以及组织进行分组展示。由于ISG(干扰素刺激基因)是干扰素（IFN）系统的重要组成部分，ISG能够通过诱导一系列抗病毒蛋白的产生，来建立细胞内的抗病毒状态，抑制病毒的复制和增殖。因此作者基于ISG评分评估了治疗前后各个细胞亚群的比例变化。
图 1 Experimental design and single-cell RNA-sequencing of myeloid cells in chronic viral hepatitis and post-DAA-cure
2.Liver neutrophil subsets revealed distinct functions and segregation between ISG-high and MHC-II-high populations
中性粒细胞再聚类成4个不同中性粒亚群并且根据已有文献报道发现均是成熟状态的粒细胞。在Neurto C3和C4分别是ISG和MHC-II高表达，此外作者会发现了PD-L1在C3中特异性表达，而PD-L1已被报道与T细胞免疫抑制高度相关，说明在病毒存在下ISGhi PD-L1hi可能会限制T细胞活化。因此作者通过IF对健康和患有HCV患者染色，发现HCV对PD-L1和MX1呈双阳性。为了进一步在小鼠体内验证和研究对ifn的免疫反应，将I型、II型和III型ifn注射到小鼠体内，并使用最佳样品处理策略收集免疫细胞的scRNA-seq图谱研究了PD-L1基因在每种免疫细胞类型中对每种IFN的表达。结果表明，在对I型和II型ifn的反应中，多种免疫细胞类型的PD-L1均有轻度上调。而中性粒细胞是IFN-a和IFN-c反应中上调幅度最大的细胞类型。表明中性粒细胞是在ifn参与的活性抗病毒过程中通过PD-1/PD-L1途径进行免疫调节的潜力最大的细胞类型。然后，又分析了中性粒细胞对DAA治疗的反应变化。通过DAAs治疗前后的中性粒进行差异分析并利用IREA发现相对于治愈后，慢性HCV中性粒细胞向ifn诱导的极化状态极化途径富集显示，最显著的变化与治愈后抗病毒活性降低有关，与病毒去除一致。然后，通过wilcox计算了每个中性粒细胞亚群中的细胞比例，以检测相对比例的变化。治疗后，isg -高Neutro_C3群体虽然仍然存在，但显著减少。
图 2 Liver neutrophil subsets and phenotypic changes after DAA-cure
3.ISG-high liver eosinophils upregulated IDO1 and contracted after virus removal
嗜酸性粒细胞再聚类成3亚群，分别Eosin_C至C3。治愈后Eosin_C1频率增加，S100A8过表达，最近被认为可以促进嗜酸性粒细胞介导的组织愈合。Eosin_C3亚群强烈表达ISG和IDO1并富集抗病毒防御程序。IDO1在病毒感染期间的T细胞免疫抑制和耐受有重要作用，并发现IDO1在嗜酸性粒细胞中组成性表达。可能是抗病毒程序诱导了更高水平的IDO1表达，从而介导T细胞调控。然后又分析了治疗前后嗜酸性粒的组成变化，C3簇显著减少，表明在DAAs治疗后能够减少感染期间，ISGhi粒细胞亚群启动的免疫调节程序。
图 3 Liver eosinophil subsets and phenotypic changes after DAA-cure
4.Liver cDCs displayed heterogeneity and had enhanced proliferative programmes after virus removal
经典树突状细胞分为1型和2型。在本研究中仅观察到了cDC2，并分为4个亚簇，C1为MHC-II介导的抗原呈递(高表达ISG和MHC-II)，C2为过渡态，C3:富含炎症标志物，而C4是表达STMN1和MCM7增殖标记物。并且发现DAAs治疗后，ISG下调，MHC-II上调。此外作者观察到增殖标记物仅在C4高表达，为了排除其他因素带来的影响，根据增值评分对每个不同细胞的亚群打分，也证明了DAAs治疗后组织CD1C+ DC获得增强的抗原呈递和增殖能力与慢性免疫衰竭的逆转有关。
图 4 Liver CD1C+ conventional dendritic cell subsets and phenotypic changes after DAA-cure
5.CD14+ monocytes in the liver formed diverse subsets, all of which were detected in both pre- and post-treatment
作者将CD14+单核细胞又分成了6个不同的亚群，并且某些群与先前中性粒，树突状和粒细胞定义的亚群存在相似性，根据GO富集分析发现C1:类似血液单核，C2:单核粒细胞来源的抑制细胞(DC细胞、巨噬细胞和粒细胞的前体,具有强大的免疫抑制活性。它们与许多病理条件下的免疫反应调节有关)，C3:ISG高表达簇，C4:MHC-II,过表达C1Q，可能在向巨噬表型分化，C5:细胞因子活性和趋化性，C6:粒细胞单核细胞。由于病理状态下，血液中的细胞会渗透到特定组织中发挥其调节作用，因此作者将血液和其他不同CD14+单核亚群进行相关性分析，发现C1和C5与血液最相关。为了探究单核的分化轨迹，以C1为分化起点，分别向S100,MHC,ISG方向分化。值得注意的是，ISG簇在治疗后也显著减少。
图 5 Liver CD14+ monocyte subsets and phenotypic changes after DAA-cure
6.Macrophage activation markers, sCD163 and sCD5L, were found in serum pre- and post-DAA and followed different dynamics
作者使用M1和M2评分对肝脏常驻巨噬细胞分析，在治疗后M2得分高，表明在DAAs处理后，可能激活了某些免疫激活标志物。CD163蛋白和CD5L糖蛋白脱落后可作为血清中可溶性CD163或sCD5L测定。血清sCD163和sCD5L水平与炎症有关。因此作者分别取了健康，以及DAAs治疗后不同时间节点进行血清检测，发现治疗后sCD163和sCD5L水平的升高可能反映了病毒清除后数月巨噬细胞介导的炎症和愈合反应的持续调节。而sCD5L持续升高可能反映了sCD5L结合和聚集病毒损伤相关分子模式(DAMPs) (HCV ssRNA和dsRNA)的能力。
图 6 Liver macrophage phenotypic changes upon DAA and serum macrophage activation marker dynamics during and after treatment
7.Global view of myeloid cell subsets and changes post-cure across cell types identifies shared gene programmes
基于上述研究，作者从髓系亚群中发现了共性和个性。如大部分亚群在治疗前均有ISG,MHC-II,S100高表达簇，值得注意的是，在治疗后ISG簇均显著减少，并且通过jaccard相似性指数发现在慢性免疫激活和消退中，骨髓细胞类型以及细胞类型特异性反应具有一定程度的共性。
图 7 A global view of cell subsets in the liver myeloid compartment and their changes post-DAA
8.A higher pre-treatment viral load was associated with a lower post-cure ISG expression in host’s immune cells
使用Pearson和Speaman对共享基因程序分析，结果表明在DAAs治疗后，ISG与治疗前病毒装载量呈负相关，而MHC-II和S100则部分正相关。
图 8 Post-cure ISG expression is inversely related to pre-treatment viral load
总结：
1.DAAs治理前后 HCV患者的ISG(干扰素刺激基因)下调
2.治疗后的ISG与治疗前的病毒装载量呈负相关
3.尽管髓系进化成不同的细胞群体，但仍共享先天免疫功能至关重要的核心程序
文章链接: doi:10.1016/j.jhep.2023.02.040.
汇报人：张瑞芬