大家好！为大家介绍一篇2024年发表在nature ageing的文章，题目为“Age-, sex- and proximal–distal-resolved multi-omics identifies regulators of intestinal aging in non-human primates”的研究论文，该研究利用转录组，蛋白质组，磷酸化修饰，代谢组等多组学技术，鉴定了与年龄、性别和近端-远端分辨多组学鉴定了非人类灵长类动物肠道衰老的调节因子。
【背景介绍】
衰老在很大程度上会导致肠道功能失调，导致40 岁以上的人肠道功能紊乱。肠道衰老包括形态变化、蠕动减慢、吸收能力下降、肠道上皮再生受损和菌群失调。然而，肠道衰老的机制，以及结肠近端和远端在疾病类型和发病方面的异质性如何，以及肠道衰老的机制及其与结直肠癌（CRC）等疾病的联系仍然难以捉摸。因此，作者进行了相关机制探究。
【研究思路】
作者通过对26只不同年龄食蟹猴的104个肠道组织进行位置特异性和性别分辨的多组学分析，证明了雄性和雌性近端和远端结肠衰老的异质性，并确定了肠道衰老的关键调节因子。此外，作者还发现了一些可能将肠道衰老与结直肠癌联系起来的蛋白质。
【研究结果】
首先，为了确定大肠衰老的分子图谱，作者收集了26只猴子的104块新鲜大肠组织，年龄，性别，大肠位置有所区别。进行了转录组，蛋白质组，蛋白磷酸化修饰，代谢组等多组学分析（图1a）。
图1a 取样方案及多组学检测
接下来，在正常的大肠组织中，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解、脂肪酸降解和色氨酸（Trp）代谢通路中，蛋白质-mRNA具有正相关性。作者在青、中、老年组的近端，远端结肠中均发现了与年龄相关的mRNA和蛋白质（图1d）。K-means分析显示，年龄相关的蛋白与mRNA有相似趋势。（图1e）。一些蛋白在中年表现出明显变化但老年时发生逆转。如结肠远端第3 组和第4 组中的蛋白质（图1e），这表明在这一特定生命阶段存在优化功能的潜在适应机制。例如，血清胆固醇水平会随着年龄的增长而升高，直至中年，然后下降，在肠道胆固醇吸收途径中也观察到类似的趋势(图1e)。脂肪酸β-氧化（FAO）是一个促进ISC（肠干细胞）再生的线粒体过程。所有年龄阶段的近端结肠中都观察到了较高水平的FAO相关转运体和酶，并且它们的表达随着年龄的增长而下降得更快（图1e ）。3-羟基丁酸 是一种关键的 FAO和酮生成产物，对调节ISC的更新和分化至关重要，它在老年个体的近端结肠中的表达量有所下降。ISC数量随着年龄而下降。3-羟丁酸可促进ISC向吸收细胞分化，可能是这些趋势的原因之一。这些发现表明，近端结肠的平衡可能更依赖于FAO和酮体生成。
蛋白质的翻译后修饰如磷酸化，密切调控着衰老过程。在近端和远端结肠中，许多磷酸化位点呈现出与年龄相关的对比趋势。老年个体中，远端结肠中磷酸化位点减少较多，近端结肠中磷酸化位点增加较多（图2a）。k-means分析显示，近端结肠中与年龄相关的磷酸位点在中年时略有减少，随后在老年时增加，而远端结肠中与年龄相关的磷酸位点则随着年龄的增长而持续减少（图2d-f）。带有这些磷酸化位点的蛋白质主要与Rho GTPases的信号转导和基于肌动蛋白丝的过程有关（图2d-f），表明磷酸化参与了细胞-细胞连接的调控。
图2 位置相关的大肠衰老的磷酸化蛋白质组分析
为了深入了解大肠衰老过程中的代谢紊乱，在近端和远端结肠中发现了三个年龄阶段与年龄相关的代谢物。与转录组学、蛋白质组学和磷酸蛋白质组学的研究结果一致，远端结肠中出现了更多与年龄相关的代谢物（图3a）。研究发现，初级胆汁酸的生物合成与年龄有关，同时近端结肠中的抗坏血酸和醛酸代谢也发生了变化。此外，作者还在近端和远端结肠中发现了与性别相关的代谢物（图3b、c）。通路富集分析强调了雄性与雌性结肠近端和远端与年龄相关的特定代谢通路的不同调控模式（图3d、e）。观察到远端区域的5-HT 通路活性更高，而近端区域则偏向于KYN 通路（图3f）。
图3 大肠衰老的位置分辨和性别分辨代谢组
由于在猴子的大肠中发现了许多与年龄相关的分子，包括mRNA、蛋白质、磷酸化位点和代谢物，而它们在大肠衰老过程中的功能仍然未知。此前在秀丽隐杆线虫中进行的研究发现，肠道衰老的特征是肠腔宽度改变和肠道萎缩。经过筛选后，利用该模型评估了37个年龄相关基因在肠道萎缩中的作用（图4b）。值得注意的是，这些基因在近端和远端结肠中表现出一致的年龄相关变化（图4c）。
为了系统评估这些基因的影响，用对照基因或靶基因RNA干扰（RNAi）处理同步化的秀丽隐杆线虫，7天后测量肠腔宽度（图4d）。 在 37 个基因中，发现23 个基因会促进肠道老化，而5个基因会阻止肠道老化（图4d）。在28个有效基因中，11个促衰老基因(ANKRD24、CABP4、DBNL、EPX、GADD45G、GATAD2B、PLA2G2A、HPX、LIPE、SH3BGR、UBAP2)(图4e、f)和4个抗衰老基因(CCT8、HMGCS2、PCK1、SLC9A3)(图4e、g)随年龄的增长分别表达增加和减少，表明它们参与了大肠衰老沉默HMGCS2(ISC分化的正调节因子)会导致管宽变宽(图4e,g)，这与之前的研究结果一致。值得注意的是，一种抗衰老基因CD82的水平随着年龄的增长而升高(图4i)，表明在衰老过程中对肠道萎缩具有潜在的保护作用。
在与肠道萎缩相关的28个基因中，已知有一些会影响生物体的寿命。值得注意的是，ATP1A3突变延长了秀丽隐杆线虫的寿命，而PCK1过表达与小鼠寿命延长相关。另外，沉默PLA2G2A和ANKRD24可以显著延长秀丽隐杆线虫的寿命。总的来说，作者确定了15个在非人类灵长类动物中驱动大肠衰老的关键基因。
接着，在大肠衰老过程中，观察到对维持肠屏障完整性至关重要的细胞-细胞连接蛋白水平显著下降。为了确定参与肠道屏障完整性调节的年龄相关基因，采用了秀丽隐杆线虫肠道渗漏模型(图5c)。正如预期的那样，衰老促进了肠道渗漏(图5d、e)。通过肠道渗透模型，发现86种蛋白质支持这一假设。将人类和秀丽隐杆线虫的同源基因进行匹配鉴定出33个感兴趣的基因(图5h,i)。通过使用RNAi分别沉默线虫中的33个基因，作者发现了8个对肠道屏障具有显著保护作用的基因，包括IMPA2、SLC25A20、CPT1A、NFU1、CCT8、TMPPE、LIPE和HARS(图5j - 1和扩展数据图6f,i)，以及10个对肠道屏障具有破坏性作用的基因，包括DTD1、HPX、SPATA5、DBNL、NUP35、SH3BGR、ATP1B1、L1CAM、SERPINC1和STX1A(图5j、k、m）。
值得注意的是，在8个保护基因中，除LIPE外，所有基因在近端和/或远端结肠中都显示出显著的年龄相关减少(扩展数据图6f,j)。相反，10个屏障破坏基因中的6个——dtd1、HPX、SPATA5、DBNL、NUP35和sh3bgr在近端和/或远端结肠中的表达随着年龄的增长而显著增加(扩展数据图6g,j)。这些结果表明，这14个基因在与年龄相关的肠道屏障破坏中起着关键作用。
图5 年龄相关基因对肠道屏障完整性的影响
而从通路分析中发现了磷酸化在细胞-细胞粘附调节中的潜在作用，因此作者的下一步是确定可能影响肠屏障完整性的特定磷酸化位点。通过差异分析，确定了127个显著变化位点(图6a)。在这些位点中，45个磷酸位点与两种以上的细胞粘附相关蛋白显著相关，如热图右侧所示(图6b)。值得注意的是，所有45个磷酸位点在人类和猴子中都是完全保守的。此外，43个磷酸化蛋白中有29个在这两个物种之间具有95%以上的相似性(图6c)。在45个磷酸化位点中，CTNND1在S349位点的磷酸化(CTNND1- s349p)在两个结肠切片中都表现出与年龄相关的下降，尽管在远端结肠中更为显著(图6d-g)。将S349突变引入E (S349E)以模拟磷酸化的作用，显著增加了细胞-细胞连接蛋白(如OCLN, CLDN1和JAM1)的表达(图6h,i)，表明年龄相关的CTNND1-S349p失调对屏障完整性破坏的贡献。
图6 年龄相关磷对肠道屏障完整性的影响
鉴于色氨酸代谢途径在近端和远端结肠的明显偏好，作者评估了色氨酸及其代谢物，包括5-HT、5-羟基吲哚乙酸(5-HIAA)、KYN、喹啉酸(QA)、犬尿酸(KYNA)和微生物来源的3-吲哚丙酸(IPA)对衰老过程中秀丽线虫肠道形态、肠核和屏障完整性的影响(图7a)。用这些化合物处理显示出对肠道萎缩的保护作用(图7b,c)，但是5-HT表现出相反的作用。此外，在漏肠模型中，仅5-HT处理增加了肠道渗漏(图7f、g)。
用右旋糖酐硫酸钠（DSS）诱导的雄性小鼠结肠炎模型（图7h） 研究结果表明，5-HT会加重结肠炎，而抑制5-HT 的生物合成会减轻这种影响（图7i-l）。近端和远端结肠的H&E 染色显示，5-羟色胺或LP-533401治疗对右侧结肠炎几乎没有影响。相反，左侧结肠炎的严重程度随着5-HT 的处理而增加，但通过使用LP-533401 抑制5-HT 的产生，左侧结肠炎的严重程度得到缓解（图7m）。这一发现强调了大肠的异质性，左侧结肠炎对5-HT 波动的反应更为敏感。
与衰老相关的表观遗传变化和衰老微环境在癌症发展中起着关键作用。对 104 个配对的CRC组织进行的蛋白质组分析表明，右侧远端正常组织（DNTs）中蛋白质随年龄的变化与猴子近端结肠中的变化一致。左侧DNT却没有这种趋势，这表明它们可能受到远端结肠肿瘤的影响。进一步研究性别对这些相关性的影响发现，男性的近端肿瘤对相应的DNT影响更大，而女性的远端肿瘤对相应的DNT 影响更明显。随后，作者开始鉴定在人类 DNT和猴子肠道中显示出一致的年龄相关变化的蛋白质。根据肿瘤蛋白水平对 CRC患者的总生存率（OS）进行了分层分析，发现了24 种蛋白，其中HPX 尤为突出。HPX被证实是大肠衰老和肠道屏障完整性的调节因子，它是50 岁以上CRC 患者预后的预测因子，这表明与年龄相关的HPX 增加可能会导致癌症进展。虽然 HPX 是一种循环蛋白，但在某些CRC 患者的DNT 中，其水平并没有相应肿瘤中的水平低。以前的研究认为，血红蛋白进入细胞后，如果没有HPX 的保护，就会诱导铁凋亡。对低HPX肿瘤中铁含量的研究发现，低HPX肿瘤中的铁含量与高HPX肿瘤中的铁含量接近。由此推测，低水平的HPX可能会让更多的铁直接进入癌细胞，从而可能导致铁嗜酸性粒细胞增多，并使CRC60患者的预后良好。作者在大肠中发现了可能与 CRC有关的年龄相关蛋白。
【总结】
综上所述，作者对非人灵长类动物的大肠衰老进行了位置分辨和性别分辨的组学表征，并验证了许多年龄相关分子的功能。这项工作产生了几个关键发现。首先，作者揭示了受性别影响的近端和远端结肠之间的异质性和异步的分子衰老模式。其次，作者确定了32个对肠道衰老至关重要的关键调节因子，包括24个基因，1个磷酸和7个代谢物。第三，作者发现远端区域的5-HT通路更活跃，而近端区域的KYN通路更受青睐。此外，远端结肠炎对5-HT波动更敏感。最后，作者在大肠中鉴定了24种可能促进CRC进展的年龄相关蛋白。
大肠异质性扩展到形态、生理功能、血供和微环境等多个方面。例如，从近端到远端结肠，黏液厚度不断增加，结肠中的B细胞呈现出活化梯度。此外，细胞周期基因和凋亡标志物在远端结肠中表达较高。本研究揭示了大肠衰老的异质性，强调了重要调节因子在近端和远端结肠之间不一致甚至相反的变化，表明不同部位的肠道衰老调节因子有不同的作用。
肌动蛋白细胞骨架是上皮连接重塑和完整性的关键，由肌动蛋白结合蛋白(ABPs)和磷酸化调节。例如，磷酸化的TJ, AJ和桥粒蛋白和磷酸化的ABPs，如cofilin (S3p)， fimbrin (T103p)和drebrin (S647p)，可以调节顶端连接复合体的组装/拆卸。有趣的是，作者观察到随着年龄的增长，在远端结肠中，与肌动蛋白丝相关的过程、Rho GTPases信号传导和细胞-细胞连接组装相关的磷酸化变化持续减少，这表明磷酸化的变化可能对远端结肠中细胞-细胞连接蛋白的稳态贡献更多。细胞间粘附中磷酸化失调的机制仍不清楚，可能是由年龄相关的影响所驱动，例如细胞间通讯的改变，激酶活性的变化和其他调节剂，如镁离子。
大肠衰老导致肠道炎症，表现为肠道屏障功能破坏、细菌进入血流和慢性炎症。生态失调和肠道衰老可干扰包括短链脂肪酸在内的有益代谢产物的产生，可能促进炎症。将作者的年龄相关基因与分子特征数据库中的炎症相关基因进行重叠分析，发现了29个基因。其中，MYC、NFKB1、CDKN1A和PSEN1影响寿命。值得注意的是，在雌性远端结肠中，NFKB1的水平随着年龄的增长而降低，它调节了小鼠的寿命。与炎症相关的信号通路，如线粒体呼吸和MAPK信号通路，也显示出与年龄相关的变化。此外，作者确定了25种与炎症相关的代谢物，其中2种具有促炎作用，23种具有抗炎作用。在这些代谢物中，不对称二甲基精氨酸是一种促炎代谢物，在女性远端结肠中随着年龄的增长而增加，而在23种抗炎代谢物中，包括尿囊素，富马酸，丙酮酸，磺基乙酸，三乙胺和KYNA，随着年龄的增长而减少，可能共同促进了炎症的加剧。
远端结肠似乎更易受到疾病或干预措施的影响。UC是慢性结肠炎的主要形式，好发于远端结肠，向近端延伸。dss诱导的结肠炎小鼠模型模拟了UC，表现出更严重的远端结肠炎，而Trp代谢物的治疗对远端结肠炎有深远的影响。此外，既往研究表明，肿瘤可能影响邻近正常组织。有趣的是，作者发现远端结肠癌可能对邻近的正常结肠组织有更大的影响，甚至延伸到10-375px以外的组织。因此，在肿瘤研究中使用dnt作为对照时必须谨慎。
汇报人：凌梦铼