HNF4调节脂肪酸氧化并影响小鼠肠道干细胞的更新

本周分享的文献是2020年发表在Gastroenterology杂志上一篇题为“HNF4 Regulates Fatty Acid Oxidation and is Required for Renewal of Intestinal Stem Cells in Mice.”的文章，本研究中将明确HNF4转录因子如何影响ISC的代谢，以及依赖HNF4的代谢调节是否参与ISC的维持。

肠上皮具有自我更新和分化潜能。肠上皮每3-5天由表达Lgr5的干细胞群更新一次。肠道干细胞（Lgr5⁺隐窝柱状细胞或ISC）及其子代细胞位于隐窝的杯状样结构中，而被称为绒毛的管腔样凸起则完全由分化的细胞组成。Lgr5⁺的ISC也是结肠肿瘤的细胞来源，对肠道损伤后的再生发挥重要作用，并动态响应不同的营养环境。

营养调节和代谢调控对干细胞的生物学功能发挥关键作用。有研究表明ISCs可响应能量限制和脂肪酸、葡萄糖、N-乙酰-D-氨基葡萄糖和氨基酸等膳食营养物质。作者及其他研究团队的研究显示，Lgr5⁺细胞极度依赖线粒体代谢，脂肪酸氧化可以为ISCs的氧化磷酸化提供原料。这些研究表明，细胞代谢在肠道干细胞稳态中发挥基础调节作用。然而，ISCs如何建立其特有的代谢状态仍不清楚。

由于多种组织中脂肪酸氧化（FAO）对干细胞的维持至关重要，ISCs中FAO调节干细胞自我更新的机制值得进一步探讨。肝细胞核因子4（HNF4）具有一个保守的配体结合域，可与脂肪酸结构性结合。HNF4A对代谢稳态具有重要调控作用，其所调节的转录基因参与肝脏脂肪代谢。HNF4A的下游靶点参与乙酰辅酶A的代谢，另有报道显示，HNF4A与乙酰辅酶A结合蛋白和酯酰辅酶A硫脂结合。在果蝇中，dHNF4可响应饮食信号，作为游离脂肪酸的感受器，并参与脂质代谢和β氧化。

肠道干细胞与肠道疾病和癌症密切相关。了解ISCs生理活性的调控机制对人类健康和再生医学具有重要意义。然而，调控ISC代谢的机制仍不清楚。鉴于FAO对干细胞维持的潜在作用以及HNF4对调控脂质代谢进程的重要性，作者在本研究中将明确HNF4转录因子如何影响ISC的代谢，以及依赖HNF4的代谢调节是否参与ISC的维持。

1.破坏FAO影响ISCs的自我更新

作者首先检查脂肪酸对肠道干细胞功能的影响。作者从小鼠肠道中分离隐窝和绒毛上皮细胞，并在具有荧光标记的棕榈酸培养基中培养，以此评估脂肪酸摄取水平。隐窝细胞在孵育的2分钟内迅速吸收标记的棕榈酸，并且荧光强度随培养时间的延长而增长，而绒毛细胞吸收脂肪的速度相对较低，但对葡萄糖类似物的吸收能力较强（Fig.1A-E）。有研究显示，Lgr5+干细胞对糖酵解抑制剂的响应较低，因此，可以推测ISC的能量代谢对脂肪酸的依赖性较高。为检测ISCs的脂肪酸摄取能力，作者从Lgr5-EGFP-IRES-Cre^ERT2基因敲入鼠中分离隐窝细胞，并在含有BODIPY^TM脂肪酸的培养基中培养，可以在Lgr5-GFP+的干细胞和其他隐窝细胞中观察到红色荧光标记的十二碳酸（Fig.1D）。为进一步检测ISCs对FAO的功能性需求，作者使用FAO氧化抑制剂（Etomoxir）处理，结果显示，Lgr5-GFP的表达呈剂量依赖性消失（Fig.1F）。Lgr5+干细胞的标记分子，包括lgr5、Olfm4、Smoc2、Msi1和Ascl2在FAO抑制剂处理后均下调（Fig.1G），表明FAO对ISCs自我更新发挥重要作用。

Figure 1. FAO is required for ISCs renewal.

2. HNF4转录因子直接激活FAO基因，并维持肠上皮的脂肪酸β氧化

肝脏条件性敲除Hnf4α可导致脂滴的积累，表明HNF4A与脂肪酸代谢相关。作者构建的Hnf4αγ^DKO小鼠的基因表达谱显示，HNF-4依赖的差异基因与脂质代谢相关。GSEA分析结果显示，脂质消耗和转运的基因，以及脂肪酸氧化的基因在Hnf4αγ^DKO小鼠中显著下调（Fig.2A-C）。在缺失HNF4的条件下，几乎涉及每一步FAO的功能性基因均表达下调，而参与脂质合成的基因表达上调。ChIP-seq分析显示，相比于脂质合成基因，促进FAO的基因可能具有HNF4的结合位点（Fig.2D-F）。HNF4A和HNF4G可直接结合到乙酰辅酶A合成酶的基因（Acsl5和Acsf2）（Fig.2G）。此外，作者的检测结果显示，HNF4A和HNF4G可以直接与Abcd1（转运极长链脂肪酸进入过氧化物酶体）、ACOX1（过氧化物酶体途径脂肪酸β氧化限速酶）和其他过氧化物酶体FAO氧化基因结合（Fig.2H）。这些FAO基因在野生型小鼠中正常表达，但在Hnf4αγ^DKO小鼠中表达显著下调，与HNF4可通过直接结合并激活这些基因的结果相一致（Fig.2G,H）。作者因此在Hnf4αγ^DKO小鼠肠上皮的细胞裂解物中检测棕榈酰辅酶A诱导的酶活性，检测结果显示Hnf4αγ^DKO小鼠肠上皮FAO活性受到破坏（Fig.2I）。作者猜测，由于FAO水平的下降，TCA代谢水平亦会受到影响LC-MC检测结果显示，Hnf4αγ^DKO小鼠绒毛细胞中TCA中间代谢产物水平降低（Fig.2J）。上述结果表明，HNF4结合并激活FAO基因，并且HNF4的缺失可导致FAO基因转录水平的降低，破坏棕榈酰辅酶A依赖的酶活性，减少TCA代谢物水平。

Figure 2. HNF4 paralogs bind to and activate FAO genes, and FAO is compromised upon HNF4 loss.

3. 肠道上皮中HNF4同源基因的缺失导致Lgr5+干细胞的缺失

由于FAO参与肠道干细胞的更新，而HNF4可促进脂肪酸β氧化，作者下一步探究HNF4是否促进ISC的功能。作者对分离的ISCs进行DNA结合基序分析，结果显示HFN4A/G基序显示为高评分（Fig.3A），表明ISC中HNF4可以发挥广泛的基因表达调控作用。ISC的RNA-seq数据表明，Lgr5+的肠道干细胞中Hnf4α和Hnf4γ高表达（Fig.3B）。免疫组化结果显示，HNF4A和HNF4G表达于肠上皮中，包括隐窝基底柱状干细胞（Fig.3C）。在Hnf4γ突变背景下，使用他莫昔芬诱导整个肠上皮中Hnf4α的敲除可导致干细胞的丢失（Fig.3D）。然而，单独敲除HNF4A或HNF4G不影响肠道干细胞的维持（Fig.3D）。在使用他莫昔芬诱导Hnf4αγ^DKO小鼠的基因敲除2天后，隐窝中的Lgr5+干细胞相关标记分子的转录水平降低（Fig.3E）。为进一步观测Lgr5+细胞群，作者构建了可以同时在整个肠上皮中失活HNF4和可观察Lgr5表达的干细胞的小鼠（Lgr5-EGFP-IRES-Cre^ERT2;Villin-Cre^ERT2; Hnf4α^f/f; Hnf4ɣ^{Crispr/Crispr}）。与OLFM4染色结果一致，在使用他莫昔芬处理Hnf4αγ^DKO小鼠4天后，无可检测到的Lgr5-GFP+干细胞（Fig.3F）。

为检测干细胞中HNF4对细胞自主性功能的影响，作者使用Lgr5-EGFP-Cre^ERT2使HNF4失活。在使用他莫昔芬处理的5天和10天可观察到HNF4A阴性的细胞，但大多数HNF4阴性细胞未被持续保留，即突变的干细胞逐渐被周围的正常健康细胞取代，此结果表明，HNF4对ISC的细胞自主性至关重要（Fig.3G）。作者也发现Hnf4αγ^DKO的凋亡水平增加（Fig.3H-I），特别是隐窝基底部位，与干细胞缺失HNF4存活能力缺失相一致。

Figure 3. Loss of HNF4 paralogs in the intestinal epithelium triggers Lgr5⁺ stem cell loss.

作者进一步使用类器官验证上述结果，研究显示，HNF4敲除后Lgr5+细胞减少，但细胞增殖水平增加（Fig.4A-D），HNF4敲除也导致类器官中干细胞标记分子水平降低，而增殖细胞标记分子水平增加（Fig.4E-H）。上述结果表明，HNF4的缺失导致干细胞失去更新能力，并促进细胞增殖水平。

Figure 4. Transit amplifying-like proliferating cells predominate in the absence of Lgr5þ cells upon HNF4 loss.

4.ISCs缺失HNF4同源物所致的表型变化可通过代谢调节恢复

上述结果已明确HNF4可结合激活FAO的基因，作者进一步检测使用U-¹³C₁₆标记棕榈酸脂的培养基培养类器官是否影响TCA循环的代谢产物（Fig.5A,B）。结果显示，在Hnf4αγ^DKO的类器官中，进入TCA循环的标记的棕榈酸酯显著减少（Fig.5C）。为确定Hnf4αγ^DKO突变条件下乙酸盐（乙酰辅酶A前体，一种主要的FAO产物）命运，作者使用U-¹³C₂标记的乙酸盐培养原代类器官，并检测TCA代谢产物和皂化脂质中U-¹³C₂的参入量（Fig.5A,B）。结果显示，Hnf4αγ^DKO突变的类器官中¹³C标记的TCA产物显著减少，而脂肪酸合成显著增加（Fig.5D,E）。上述结果表明，HNF4缺失导致乙酰辅酶A从进入TCA循环转向进入脂肪酸合成途径。

Figure 5. Loss of HNF4 paralogs leads to compromised TCA cycle contribution and elevated fatty acid synthesis.

为检测破坏FAO是否促进干细胞的丢失，作者使用FAO抑制剂Etomoxir处理类器官，结果显示，FAO抑制剂处理可加速Hnf4αγ^DKO类器官的形成（Fig.6A）。如果FAO缺陷是Hnf4αγ^DKO类器官缺失干细胞的重要因素，作者考虑提供乙酸盐是否可恢复上述表型改变（Fig.6A,B）。结果显示，低剂量乙酸盐不能恢复球状类器官结构，但可诱导Lgr5表达，而高剂量的乙酸盐可恢复球状表型、促进Lgr5的表达并恢复Lgr5干细胞标记分子的表达（Fig.6C-E）。

上述结果表明乙酰辅酶A的缺陷可能是限制干细胞更新的重要因素。丙酮酸氧化是乙酰辅酶的的另一来源。由于丙酮酸氧化基因在Hnf4αγ^DKO条件下未改变，作者检测二氯乙酸盐（DCA，一种促进丙酮酸氧化的化合物）是否也可以恢复Hnf4αγ^DKO突变诱导的表型改变，实验结果显示，10mM的DCA可恢复Lgr5+细胞表型（Fig.6F）。综上所述，FAO促进干细胞自我更新。HNF4可结合并激活FAO基因，其缺失加速脂肪酸合成，乙酸盐的补充可抑制Hnf4αγ^DKO诱导的干细胞丢失，表明HNF4可能通过促进β氧化参与干细胞自我更新的维持。

Figure 6. Acetate supplementation restores TCA cycle metabolites and ISC renewal.

此研究发现，HNF4转录因子对ISC更新是必不可少的，因此提供了控制肠道特性的基本转录调节网络与ISC功能必不可少的代谢程序之间的联系。

汇报人：吴棋芳

文章链接：DOI: 10.1053/j.gastro.2019.11.031