大家好！为大家介绍一篇2023年发表在Journal of Crohn’s and Colitis的文章，题目为“Epigenetic and Metabolic Reprogramming of Fibroblasts in Crohn’s Disease Strictures Reveals Histone Deacetylases as Therapeutic Targets”。文章表明，CD患者肠道狭窄部位与 非狭窄部位的成纤维细胞相比，HDAC 表达谱增加、H3K27ac 低乙酰化、糖酵解显著增加，文章揭示了I型胶原调节和TGFβ介导的CD纤维化的新表观遗传成分。HDAC抑制剂治疗可能会“重置”与纤维化相关的表观遗传变化。

【背景介绍】

  目前我们对克罗恩病（CD）中驱动纤维化和狭窄形成的分子、表观遗传和代谢机制的理解不完整，限制了新治疗靶点的识别。纤维化是一种透壁过程，其特征是细胞外基质（ECM） 沉积增加以及由成纤维细胞介导的粘膜下层和平滑肌层增厚，成纤维细胞是 ECM 蛋白的主要来源。TGFβ 促进成纤维细胞活化、ECM 合成（例如胶原 I 产生）和CD肠道狭窄（SCD） 的发展。重要的是，TGFβ 影响成纤维细胞代谢并受其调节

组蛋白脱乙酰酶（HDAC）是基因表达的表观遗传调节因子，是包括炎症和癌症在内的一系列疾病的潜在治疗靶点。丙戊酸（VPA）靶向 I 类（HDAC1–3 和 8）和 IIa 类（HDAC4–5、7 和 9） HDAC，并且可以恢复赖氨酸 27 （H3K27ac）位点的组蛋白-H3低水平乙酰化，赖氨酸 27 是公认的 HDAC 活性替代标志物。VPA在许多疾病模型中抑制纤维化，但其作用机制尚不清楚。

【研究思路】

  作者探讨了组蛋白乙酰化、HDAC 表达以及与 SCD 和 CD 小肠非狭窄 [NSCD] 区域相关的代谢特征的变化。VPA 诱导的 HDAC 抑制对表观基因组、代谢组、基因表达和促纤维化信号通路的影响在细胞系和来自手术切除标本的原代 CD 成纤维细胞培养物中进行评估。

【实验结果】

1、H3K27ac 的 HDAC 表达增加和低乙酰化与 CD 狭窄的形成有关

与NSCD肠段相比，SCD的粘膜中HDAC mRNA表达增加[n=6]。此外，与NSCD粘膜相比，SCD的胶原基因表达显著增加。因此，在之前发表的 scRNA-seq 数据集 [https://www.ebi.ac.uk/biostudies/arrayexpress/studies/E-MTAB-11792] 中评估了从 SCD 和 NSCD 回肠全层切片分离的原代成纤维细胞的 HDAC 表达。揭示了与四个成纤维细胞簇相关的HDAC表达的不同特征，特别是HDAC2和HDAC7。在从 CD 患者切除标本中分离的 SCD 和 NSCD 肠道的 FFPE 切片中使用 IHC 记录了 HDAC2 定位，HDAC2 表现出“开”或“关”表达模式，阳性细胞的评分发现，相对于 NSCD，SCD 组织的粘膜中 HDAC2 阳性基质细胞增加。

为了评估HDAC 表达差异的后果，在 SCD 中对 H3K27ac 阳性细胞的分数进行评分。与健康对照相比，SCD样本粘膜中H3K27ac +细胞的数量减少。SCD粘膜和固有肌层中H3K27ac +细胞显着减少。与整个狭窄期间HDAC活性的增加一致，并且与纤维化组织学程度的显着增加有关。总的来说，这些数据强调了 H3K27ac 的减少与 SCD 中 I 类 HDAC 表达的增加一致。

2、在CCD-18co细胞系和原代CD成纤维细胞中，VPA抑制了TGFβ引起的促纤维化

  使用主成分分析 [PCA] 作为降维方法。根据代谢物谱，通过TGFβ处理分离CCD-18Co培养物的前两个主成分[PCs]。VPA部分逆转了这种效果，但不是完全逆转。当沿复合轴[2PC1-PC2]考虑时，TGFβ处理诱导了显著差异，表明VPA确实改变了对TGFβ的反应。对单个代谢物的分析证实了PCA的结果，TGFβ显著改变的代谢物多于VPA。重要的是，受TGFβ 影响最大的是羟脯氨酸[OHPro]，这是胶原蛋白产生的标志物。在外代谢组分析中，VPA部分抑制了TGFβ诱导的糖酵解转变，其特征是乳酸产生的变化。在外代谢组学和内代谢组学数据中，SCD 成纤维细胞在代谢上与 NSCD 成纤维细胞不同。与NSCD成纤维细胞相比，SCD中细胞外乳酸的增加与治疗效果无关，表明转向糖酵解表型。在 SCD 细胞中，TGFβ 处理导致葡萄糖显着增加，VPA 完全消除这种影响。在SCD和NSCD背景中，分别有12种和8种代谢物在p < 0.001时显著[共6种]，SCD的p值比NSCD样品更显著。GABA作为与HDAC活性无关的阳性对照，在两种背景下都非常显着。SCD细胞与NSCD细胞的代谢不同，糖酵解活性和胶原蛋白产生增加。总体而言，VPA倾向于抵消TGFβ的代谢作用，特别是OHPro的变化

3、VPA 增加组蛋白乙酰化，抑制 TGFβ 信号传导，并抑制肠成纤维细胞中的 Collagen-I

在CCD-18Co细胞以及原代SCD和NSCD培养物中评估了抑制HDAC活性对TGFβ信号传导和胶原I生成的功能影响。在 CCD-18Co 成纤维细胞中，VPA 处理显着增加了阳性 H3K27ac，并抑制了TGFβ 诱导的Collagen-I mRNA和蛋白质水平上调，这与代谢组中 OHPro 的变化一致。与 SMAD 信号通路在纤维化中的作用一致，TGFβ 增加了成纤维细胞 SMAD2 和 SMAD3 磷酸化。单独的SMAD4抑制不太可能解释VPA观察到的胶原I的减少，因为CCD-18Co细胞中SMAD4的选择性敲低降低了刺激的TGFβ1|1表达，但不影响TGFβ或VPA对胶原I表达的影响，这意味着VPA介导的对胶原I的抑制受不同机制的调节。VPA抑制对照细胞和TGFβ刺激细胞中的Pro-collagen-1α1，这表明VPA具有TGFβ依赖性和TGFβ非依赖性作用。在没有TGFβ刺激的情况下对Pro-collagen-1α1的影响在3D器官型肠道模型中得到验证，其中VPA也抑制凝胶收缩。

  VPA的抗纤维化作用在原发性CD患者来源的肠成纤维细胞中得到验证。作者通过IF确认了VPA介导的H3K27ac和Collagen-I的变化。与 NSCD 小肠组织相比，TGFβ1|1 在 SCD 中上调，并且，与CCD 18co细胞一样，原代CD肠成纤维细胞中的水平也受到VPA的抑制。与NSCD培养物相比，VPA在SCD中的作用最为明显。因此，VPA仅在SCD培养物中显著下调Collagen-I和TGFβ1|1，而不在NSCD。当用TGFβ刺激原代培养物时，NSCD和SCD培养物都显示TGFβ1|1的表达增加，TGFβ1|1被VPA抑制。TGFβ1|1敲低抑制TGFβ诱导的胶原I上调。然而，TGFβ仅在SCD培养物中诱导胶原I，并且这种增加再次被VPA阻断，表明NSCD和SCD培养物之间胶原调节存在差异。

这些结果与SCD原代成纤维细胞培养物的qPCR数据一致，其中VPA在所有测试条件下抑制COL1A1、COL1A2、TGFβ1|1和SMAD4 mRNAs水平，但也增加了对照细胞中MMP1的表达。在TGFβ刺激的培养物中，VPA阻断成纤维细胞活化标志物（如ACTA2）的上调。在有或没有 VPA 培养的 CD 粘膜活检中观察到类似的 mRNA 表达变化，与从具有炎症表型的 CD 患者培养的活检相比，从具有 SCD 表型的 CD 患者培养的活检中观察到最显着的影响。

4、VPA 对 Collagen-I 的抑制与染色质可及性降低介导的 COL1A1 和 COL1A2 启动子的基因转录减少有关

由于先前的数据表明 VPA 对 Collagen-I 的抑制与其对 SMAD 信号传导的影响无关，因此使用 CCD-18Co 细胞系和使用单细胞染色质可及性分析 [scATAC-seq] 研究了替代作用机制。VPA 增加了 875 个启动子的染色质可及性。VPA 还降低了 387 个基因的启动子可及性，这与MsigDB中的5个标志性通路显著相关，包括上皮间充质转化 [EMT]、TGFβ 信号传导和通过 NF-κB 通路的 TNFα 信号传导。

然后将启动子可及性数据与RNA基因表达阵列数据进行交叉比较，以确定启动子可及性变化与转录变化相关的基因，鉴定了 766 个上调基因和 604 个下调基因 .上调和下调基因均与MsigDB的EMT通路显著相关[附表S10].下调基因也与炎症通路有关。66个上调基因的表达与启动子可及性的增加相关，31个下调基因（包括CO1A1和COL1A2）的表达与启动子可及性降低有关。这支持了VPA对Collagen-I的影响是由其对染色质重塑的影响介导的假设。这些数据表明，使用HDAC抑制剂可以通过表观遗传调控来调节关键的促纤维化基因，为研究更特异性的HDAC抑制剂开辟了道路。

【总结】

1、SCD 组织粘膜和固有肌层中表现出 H3K27ac⁺ 细胞百分比降低，表明所有 SCD 肠层中都存在低乙酰化。

2、用VPA处理CCD-18Co成纤维细胞和原代CD成纤维细胞，代谢组分析表明，HDAC活性与OHPro的变化呈正相关，OHPro是胶原蛋白的关键成分。

3、TGFβ抑制SMAD3 RNA和蛋白质，同时增加SMAD3磷酸化。

4、VPA抑制Collagen-1的产生是由其抑制HDAC从而调节染色质结构的能力介导的，通过 scATAC-seq证明 VPA 处理的成纤维细胞的表观遗传重塑，与成纤维细胞活化相关的启动子的染色质可及性降低，包括COL1A1 和 COL1A2 启动子的基因转录减少。

汇报人：杜学婷