本周分享的文献是2023年10月3日发表在Cell Metabolism杂志上一篇题为“Hyodeoxycholic acid alleviates non-alcoholic fatty liver disease through modulating the gut-liver axis”的文章，研究发现猪去氧胆酸通过调节肝肠轴延缓非酒精脂肪肝。

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)以肝脂肪变性为特征，可发展为肝脂肪性肝炎、肝硬化，甚至肝细胞癌(HCC)。NAFLD在世界范围内的日益流行给全球经济带来了巨大的负担。同时胆汁酸（BA）是一组由肝细胞中的胆固醇合成的两亲性分子，释放到肠道中，并被肠道微生物群进一步代谢和修饰。BA与肠道微生物群的串扰与包括NAFLD在内的代谢疾病有关，在调节宿主葡萄糖和脂质代谢中发挥着重要作用。

作者通过两组临床队列研究发现，NAFLD个体中HCA种类与TBA的比例随着NAS的增加而逐渐下降（图1B）。与健康对照相比，NAFLD患者的 HCA + GHCA/TBA 和 HDCA + GHDCA/TBA 比率显着较低（图 1 C）。HCA种类/TBA和HDCA+GHDCA/TBA与NAS呈负相关（图1D ）。并且进一步比较了患有或不患有 T2DM 的 NAFLD 患者中 HCA 种类的水平。178例NAFLD患者被分为不伴T2DM的NAFLD（NAFLD-N，n = 69）和伴T2DM的NAFLD（NAFLD-DM，n = 109），NAFLD-DM组的HCA与TBA的比例相对较低与 NAFLD-N 组相反（图 1 E）。与队列 1 结果一致，与健康组相比，肝脂肪变性组中 HCA 种类与 TBA 的比率较低（图 1 G）。Spearman相关分析显示，HCA种类与TBA、HCA+GHCA与TBA、HDCA+GHDCA与TBA的比值与HSI呈负相关。

为了验证临床队列研究结果，我们研究了两种肝脂肪变性小鼠模型中 HCA 种类的水平：长期HFD模型（动物实验 1）（图 1 I）和 STAM 模型（动物实验 2）（图1） 1K）。肝组织的 BA 分析显示，随着 HFD 饲喂时间的延长，HCA 种类的浓度逐渐下降，尤其是 HDCA + THDCA（图 1 J）。在NAFLD进展的不同阶段，HDCA+THDCA的浓度显着低于对照（图1L）。

在之前实验结果的基础上，作者进一步评估了HDCA和猪胆粉（bilepowder，从猪胆汁中提取的富含HDCA的粉末）对NAFLD小鼠模型的治疗效果。HDCA的剂量为 100 mg/kg/天，患有弥漫性肝脂肪变性的 HFD 喂养小鼠被给予猪胆粉或纯化的 HDCA 8 周（动物实验 4，图 2A）。结果表明，胆粉和HDCA显着减少了肝细胞中积累的过量脂滴（图2B和2C）和肝脏重量（图2D）。干预组中肝脏TG浓度降低，而肝脏TC几乎保持不变（图2F）。考虑到 IR 在 NAFLD 发病机制中的关键作用，胆粉或 HDCA 治疗的小鼠改善了口服葡萄糖耐量和胰岛素敏感性。此外，与 HFD 组相比，胆粉或 HDCA 干预后，与脂质生物发生相关的肝脏基因（Srebp1c、Acc-1、Fas）和脂滴形成（Cidea）的表达下调。

作者还进一步评估了 HDCA 在两种 NAFLD 小鼠模型中的治疗效果，包括胆碱缺乏、氨基酸限定、高脂肪饮食 (CDAHFD) 诱导的肝纤维化（动物实验 6，图 2 G）和 db/db小鼠。两种治疗剂OCA和 UDCA 由于报道对肝病具有治疗作用而被用作阳性对照。我们发现HDCA治疗后肝脏TG、组织学评估（脂肪变性、气球样变、炎症和纤维化评分）和血清ALT均显着改善（图2H- 2M）。

。基因层次聚类数据显示，除 HFD 组外，对照组、HFD + 胆粉和 HFD + HDCA 组聚类在一起（图 3 A）。根据KEGG功能途径数据分析，初级胆汁酸生物合成途径受到显着影响（图 3 B）。基因丰度火山图发现，Cyp7b1显着上调，同时Cyp7a1下调（图 3C），表明 BA 生物合成过程响应 HDCA 干预从经典途径转变为替代途径（图 3D）。qPCR 和蛋白质印迹分析验证了 RNA-seq 的结果，即CYP7A1下调，同时CYP7B1表达显着上调（图 3E、3F）。我们进一步设计了肝脏Cyp7b1敲低/敲除（动物实验 8 和 9）和过表达（动物实验 10）小鼠模型，以证实 CYP7B1 在 HDCA 有益作用中的潜在作用。我们设计了一种腺相关病毒 (AAV)-短发夹RNA (shRNA)，在 HFD 喂养 20 周后靶向肝脏敲除Cyp7b1，随后给予载体、HDCA 或胆粉 8 周（图 3G）。肝脏组织学结果显示，与 shControl 组类似， HDCA 或胆粉的治疗效果在 sh Cyp7b1小鼠中受损（图 3H、3I）。另一方面，相对于AAV对照组和HFD组，当肝脏Cyp7b1过表达时，肝脏中脂肪的大量积累大大减少。同时，脂肪变性评分可以验证组织学观察结果（图3 L）。这些结果表明，CYP7B1驱动的BA替代生物合成在减轻肝脏脂肪变性中发挥着至关重要的作用，也可能是HDCA抗NAFLD作用的关键机制。

先前的研究表明，BA 合成酶可以通过 BA-肠道FXR信号传导进行调节20 , 21并且 HCA 物质可以抑制肠道 FXR-成纤维细胞生长因子 (FGF)15/19 信号传导。在本研究中，HDCA 或胆粉在不同小鼠模型中均抑制肠道 FXR-FGF15 信号传导，如肠道 mRNA、蛋白表达、 FGF15血清水平（图 4 A-4C）。为了证实 HDCA 对 FXR 通路的抑制作用，作者培养了小鼠肠道类器官，并在体外观察到 FXR 靶基因表达的减少（图 4D和 4E）。这些结果表明 HDCA在体内和体外抑制肠道 FXR 信号传导，并且是肠道中的主要 FXR 调节剂。当我们使用肠道限制性 FXR 抑制剂甘氨酸-β-鼠胆酸 (Gly-MCA)来模拟 HDCA 对肠道 FXR 信号传导的影响时，我们发现肝脏 CYP7A1 和 CYP7B1 均上调（动物实验 11）（图 4 F- 4H)，与上调 CYP7B1 和下调 CYP7A1 的 HDCA 的效果不同。这种差异表明还有其他因素导致BA 合成的改变，从经典途径转变为替代途径。我们假设 HDCA 诱导的肠道微生物群改变可能有助于减轻肝脂肪变性。

为了确定肠道微生物群在 HDCA 诱导的肝脂肪变性改善中的作用，在小鼠中进行了粪便微生物群移植 (FMT)（动物实验 12）（图 4 I）。HFD组和HFD+HDCA组小鼠供体的粪便经抗生素抑制肠道微生物后分别植入假无菌小鼠体内。与 FMT-HFD 组相比，接受 HFD + HDCA 组粪便的小鼠肝脏脂肪积累减少（图 4 J）。此外，与接受 HFD 组肠道微生物群的小鼠相比，它们还表现出较低水平的 TC、TG、ALT 和 AST（图 4K）以及改善的葡萄糖稳态（图 4L ）。这些结果表明， FMT 和抗生素小鼠的这些代谢表型和 BA 合成模式证实了肠道微生物群在 HDCA 对肝脂肪变性的治疗作用中的关键作用。

为了确定胆粉和 HDCA 如何影响重塑的肠道微生物群，对HFD、HFD + 胆粉和 HFD + HDCA 组的盲肠内容物进行了宏基因组测序。在门水平上，经胆粉和HDCA处理后，厚壁菌门显着减少，而拟杆菌门显着增加（图5B）。在物种水平上，进行了微生物相对丰度的火山图，属于拟杆菌门的Parabacteroides distasonis（P. distasonis）很突出，在HFD+胆粉和HFD+HDCA组中急剧增加（图5C和5D）。为了研究 HDCA、CA 和 CDCA 对P. distasonis生长的影响，我们进行了生长曲线分析，并补充了每种 BA 50 μM。结果表明，HDCA比CA和CDCA更能 加速P. distasonis的生长，这表明HDCA为P. distasonis的繁荣提供了有利的环境（图5E）。

然后，我们探索了受 HDCA 和胆粉影响的微生物组功能，发现根据 VIP 评分，与 HFD 组相比，不饱和脂肪酸途径的生物合成显着增加（图 5 G）。定量代谢物分析表明，活P. distasonis单定殖后，肝脏和盲肠中的不饱和脂肪酸，尤其是 γ-亚麻酸 (C18:3) 显着增加（图 5H 和5I ）。我们发现P. distasonis在 HFD 提取物中培养时会在很短的时间内产生 γ-亚麻酸 (C18:3)（图 5 J）。

基于上述结果，我们怀疑P. distasonis衍生的脂肪酸通过转录因子调节肝 BA 合成酶。基于RNA-seq数据的肝脏转录因子分析结果显示，PPAR信号通路显着上调（ 图6A）。鉴于 PPARα 公认的配体是脂肪酸，我们怀疑P. distasonis衍生的 γ-亚麻酸诱导的 PPARα 调节 BA 合成酶的表达。原代小鼠肝细胞与 PPARα 激动剂、吡尼尼克酸(Wy-14643) 和梯度浓度的 γ-亚麻酸共培养。我们的结果表明 CYP7A1 受到抑制（图 6 B）。为了研究 γ-亚麻酸调节 CYP7A1 的机制，我们检测了吡尼尼克酸 (Wy-14643) 和 γ-亚麻酸对 CYP7A1 的转录调节。我们发现 PPARα/RXRα 的过表达降低了 CYP7A1 荧光素酶（pGL2000 和 pGL1000）活性，并且在 293T 细胞中添加吡尼酸和 γ-亚麻酸后，该活性进一步降低（图 6 C ）。然后我们使用Pparα −/−小鼠，通过组织学特征和生化分析评估，发现在 HFD 喂养 12 周后，HDCA 和P. distasonis并没有显着改善这些小鼠的脂肪肝表型（图 6 D-6H） 。最后，我们使用了FGF19和 PPARα 激动剂作用于原代肝细胞，以模拟肠-肝轴对 CYP7A1 的综合影响。结果表明，当与 PPARα 激动剂和低剂量 FGF19 共培养时，CYP7A1 受到抑制（图 6 I）。

尽管 HDCA 已被证明具有肠道 FXR 拮抗作用，但小鼠的肝脏活性并未受到抑制，甚至被激活。鉴于 PPARα 和 FXR 之间的分子联系，我们使用 PPARα 激动剂（Wy-14643 和 pemafibrate）进行实验来处理原代肝细胞，并观察到 FXR 表达上调（图 6J 和 6K ）。我们认为，肝脏 PPARα 被 γ-亚麻酸激活，进而激活肝脏 FXR。

综上所述，HDCA 通过抑制肠道 FXR 激活以 CYP7B1 为中心的替代途径，并通过 P. distasonis -γ-亚麻酸 -PPARα 信号传导抑制以 CYP7A1 为中心的经典途径，从而改变肝脏 BA 合成途径。

汇报人：吴郁

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.cmet.2023.07.011