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    “人类基因组计划”成功测定出人类染色体中30亿个碱基对组成的DNA序列，是人类科学史上的一个伟大工程，与“曼哈顿原子弹计划”和“阿波罗登月计划”并称为“人类三大科学计划”。

    通过该计划，科学家已经全部解码人类基因组DNA序列，但是仍然很难原位解析这些DNA序列的活性与功能。活细胞基因组DNA成像可以原位、动态的解析染色体基因组DNA定位和功能，有助于解析染色体的三维组织及其动态信息，时空揭示活细胞染色体生物学功能，剖析相关疾病的发生机制。

    基于 CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）/Cas9基因编辑技术不仅被广泛用于基因组DNA编辑，而且融合荧光探针来成像基因组DNA。这些成像探针主要是催化失活的 Cas9（dCas9）融合荧光蛋白或sgRNA招募荧光蛋白融合的 RNA 结合蛋白（例如dCas9-GFP或者MS2-MCP体系）。然而，这些荧光蛋白都是利用了持续发光的荧光蛋白。未与基因组位点结合的荧光蛋白遍布整个细胞核，产生背景噪音荧光，严重干扰基因组DNA成像的效率。此外，这些持续发光的荧光蛋白通常会聚集在核仁中，产生非特异性核仁信号，进一步降低了DNA成像效率。

    为了解决上述问题，2024年1月31日，中国科学院北京生命科学研究院李幸研究员课题组在Nature Communications 上发表了文章 Fluorogenic CRISPR for genomic DNA imaging，研发了荧光响应CRISPR(fluorogenic CRISPR, fCRISPR) 体系，在活细胞中示踪染色体的功能。fCRISPR可实现荧光蛋白在标记基因组DNA时发光，而不标记基因组DNA时不发光的条件发光特点，从而解决了传统的荧光蛋白标记DNA时出现高背景噪音的问题。此外，fCRISPR示踪了染色体动态的异质性，标记了畸变染色体，并精细观测DNA双链断裂和修复过程，揭示染色体修复过程的多样性。

    为了解决CRISPR/dCas9示踪基因组DNA时背景噪音问题，团队构建了低背景、荧光响应的fluorogenic CRISPR (fCRISPR）成像体系。为构建fCRISPR体系，团队将“荧光蛋白”探针改造成RNA响应的“荧光响应蛋白”，随后通过CRISPR/dCas9来标记目标DNA (图1A)。fCRISPR只有在结合到DNA靶标时，“荧光响应蛋白”才会发出荧光，在未结合到DNA靶标时“荧光响应蛋白”会被细胞蛋白酶体降解从而不发荧光 (图1)。因此fCRISPR能够低背景、高信噪比和高灵敏地追踪活细胞中基因组DNA位点 (图1)。

    基于fCRISPR成像体系，团队追踪到各类人源活细胞的染色体，以及不同低拷贝的基因组DNA位点。此外，fCRISPR应用于多条染色体的正交成像，实时追踪染色体动力学，监测和对比癌变细胞端粒长度。最后，团队深入研究了染色体双链断裂（DSBs）及修复的过程，观察到染色体的重复切割与修复、同源重组修复等事件，时空研究了染色体DNA损伤及其修复后的生命活动。因此，该技术对于研究疾病染色体的生物学机制和病理进展具有重要意义，并未疾病的治疗和诊断提供关键信息，也可为基于基因组DNA药物的靶点筛选提供有力帮助。

    综上所述，fCRISPR为原位解析人体DNA的活性与功能提供了一个高亮、低背景、高信噪比、高灵敏的成像工具。

图 1. fCRISPR染色体示踪体系。(a)团队针对传统持续发光荧光蛋白在标记DNA时造成的高背景、低灵敏度、低信噪比等问题，建立了高灵敏度fCRISPR示踪体系。(b-e)fCRISPR（红色，tdTomato-tDeg探针）降低了未标记DNA的荧光蛋白噪音，提升了DNA标记的信噪比，以实现高灵敏度示踪染色体。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41467-024-45163-9