甾体广泛存在于植物、动物和微生物中，且具有多种强效的药理活性。甾体类药物（>400）是继抗生素之后第二大类药物，已被广泛用于风湿病、心血管疾病、器官移植、内分泌失调等多种疾病的治疗。6/6/6/6/5五环甾体是近年新发现的一类罕见甾体，由经典的环戊烷多氢菲甾体母核与额外的六元环骈合而成（图1）。1995年，Hyodo等人从青霉菌属BM-99的培养液中分离并鉴定出第一个6/6/6/6/5五环甾体Ergophilone A和B。截至目前，仅有< 20个此类五环甾体从Penicillium、Asperaillus、Phoma和Gymnasella属真菌中分离鉴定出来。多个五环甾体表现出有趣的生物活性。例如，Ergosterdiacid A和B可显著抑制LPS诱导的NO产生，其IC50分别为4.5和3.6μM。然而，受限于自然界中较低的含量，此类甾体化合物深入的化学生物学和药物化学研究难以开展。此外，目前尚无此类甾体的合成报道。
图1. 代表性五环类固醇（来源：Org. Lett）
近日，中南大学周应军、邓旭课题组在生物合成途径的启发下，发展了一种DDQ介导的麦角甾醇衍生物和亲双烯体的脱氢Diels-Alder/芳构化串联反应，可以中等至较好的收率一步直接得到6/6/6/6/5五环甾体衍生物，并通过活性筛选发现4个衍生物（2h、4f、5b和5f）具有良好的抗炎活性、且细胞毒性较小。该研究不仅实现了五环甾体的快速、仿生合成，还揭示了此类分子作为高效、低毒抗炎药物的潜力。
（来源：Org. Lett）
成果简介
中南大学周应军、邓旭课题组长期从事基于新颖结构活性天然产物的药物化学与化学生物学研究。由于五环甾体新颖的结构骨架和丰富的生物活性，引起了作者的极大兴趣，尝试发展一种合成方法实现此类甾体的高效合成。从生源合成途径的角度，此类五环甾体可能由麦角甾烷类化合物与另一分子的亲双烯体（如马来酰亚胺、富马酸等）在酶催化下，发生Diels-Alder加成以及后期的官能团化形成的加合产物。
受此生源合成途径的启发，作者以便宜易得的麦角甾醇为原料，尝试通过两步法：先在D环引入双键，再与亲双烯体发生Diels-Alder反应和脱氢芳构化，从而生成目标产物。为了在D环C14-C15位引入双键，作者起初以Pd(OAc)2为催化剂、1,4-苯醌为氧化剂，在酸性条件（AcOH）下，进行了尝试。有趣的是，该反应以21%的收率、一步得到五环甾体衍生物2a。对照试验发现，PdII催化剂并非必须。进一步通过大量的条件优化，作者优选出最优反应条件：6当量1,4-苯醌作为氧化剂，AcOH作溶剂，60℃条件下反应，以57%的收率得到五环甾体衍生物2a。
然而，上述反应条件对于非醌类亲双烯体（如马来酰亚胺）并不适用。为避免1,4-苯醌自身参与反应而导致反应复杂化，需换用仅表现出氧化性、不参与Diels-Alder反应的氧化剂。通过筛选发现，DDQ是最优选择。进一步优化发现，反应的分步操作对产率也有较大影响——先加入1.2当量的DDQ再在较低的温度下处理麦角甾醇，使其发生烯丙位脱氢氧化，生成活性中间体；然后加入亲双烯体和另一批DDQ，使其发生Diels-Alder加成及脱氢芳构化，最终以47%的收率得到五环甾体3a。值得一提的是，醌类底物也可在此条件下生成五环甾体衍生物。
图2. 五环甾体的仿生合成（来源：Org. Lett.）
筛选出最优反应条件后，作者进一步探究了该反应的底物适用性和局限性（图2）。结果表明，对于醌类底物而言，反应在无取代的双键上发生，且吸电子取代的醌类底物产率较高；而对于非对称、含取代基的醌类底物，反应得到一对区域异构体，区域选择性较差。
图3. 醌类底物（来源：Org. Lett.）
对于非醌类底物，多种N-取代的马来酰亚胺、马来酸酐均可以中等至较好的收率得到目标产物；而其他亲双烯体（如肉桂酸、丁炔二酸、富马酸等）则无反应。从甾体的角度来看，麦角甾醇及其不同侧链取代的衍生物、7-脱氢胆固醇均可顺利得到五环甾体产物，而其他B环不存在1,3-二烯片段的甾体底物则无反应，提示该1,3-二烯片段的重要性。此外，作者以化合物2a和2h为例，两种方法均可以克级规模合成得到目标产物。
图4. 非氧化型双烯体作为底物（来源：Org. Lett.）
从反应机理的角度来看，麦角甾醇衍生物1在醌类氧化剂条件下，先在D环C14-C15位发生烯丙位脱氢氧化，生成三烯中间体I；进而与亲双烯体发生Diels-Alder反应，生成加合产物III；后者进而在醌类氧化剂条件下，进一步发生脱氢芳构化，得到中间体IV；最后发生β-消除形成最终产物。为了验证上述机理，作者尝试对中间体进行分离，最终成功分离到少量中间体IV，证明了其合理性。
（来源：Org. Lett.）
在获得一系列五环甾体衍生物之后，作者利用脂多糖（LPS）刺激的RAW264.7细胞模型评价了其对促炎因子（TNF-α、IL-1β和IL-6）表达的影响。结果表明，四个五环甾体衍生物2h、4f、5b、5f表现出较强的、抑制炎症因子表达的活性，且上述化合物对鼠源RAW274.7细胞、人正常细胞HEK-293T无明显的细胞毒性，表现出较好的安全性。
图5. 类固醇对lps刺激RAW264.7细胞促炎因子基因表达的抑制作用及构效关系（来源：Org. Lett.）
进一步研究发现，五环甾体衍生物2h、4f、5b、5f可以浓度依赖性地抑制LPS诱导的RAW264.7细胞ROS水平升高及iNOS的表达，进一步确证了上述化合物的抗炎作用。作者还进一步验证了上述五环甾体衍生物是否会引起糖皮质激素长期治疗常见的代谢副作用。结果表明，上述化合物（尤其是5b）在HepG2和LO-2细胞中对酪氨酸转氨酶（TAT）的表达影响较小，表现出较低的代谢毒副作用风险。
图6. 甾体在LPS刺激的RAW264.7细胞中的抗炎作用（来源：Org. Lett.）
该研究的意义在于：（1）首次发展了一种从易得且廉价的麦角固醇衍生物，通过DDQ介导的脱氢氧化/Diels-Alder加成/脱氢芳构化串联反应，一步快速合成6/6/6/6/5五环甾体衍生物的方法；（2）发现多个五环甾体衍生物表现出强效抗炎作用，且低毒副作用小，是新型甾体抗炎药物研发提供了理想的先导化合物。
以上工作以“A Dehydrogenative Diels–Alder/Aromatization Sequence to Access 6/6/6/6/5 Pentacyclic Steroids: Their Anti-inflammatory Activities”为题发表在Org. Lett.（DOI: 10.1021/acs.orglett.4c03899）上，第一作者为中南大学硕士生彭玲芳、硕士生范凯强和硕士生周雨星。通讯作者为中南大学邓旭副教授和周应军教授（论文作者：Ling-Fang Peng, Kai-Qiang Fan, Yu-Xing Zhou, Tao Feng, Peng Zhan, Ying-Jun Zhou,and Xu Deng）。