【研究背景】

以功能核酸为识别元件和纳米材料为能量转换模块的电化学生物传感器因其灵敏度高、反应速度快等优点，已被广泛应用于疾病相关生物标志物的体外诊断。然而，目前所开发的固载电化学传感器的传感过程涉及固-固/固-液相界面上的多相反应过程，局部空间位阻限制了靶标-探针和探针-电极的可及性，极大地阻碍了识别效率；此外，固定化过程固有的缺点，如繁琐的修饰、修饰电极的不均匀性和修饰探针的不可控堆积密度，严重限制了电化学检测的重复性。

本课题组开发了一种基于氧化还原主客体结构的免固载比率电化学纳米传感器，实现对生物标志物的高可及性和重复性检测。以Redox Host-Guest Nanosensors Installed with DNA Gatekeepers for Immobilization-Free and Ratiometric Electrochemical Detection of miRNA为题发表在《Small Methods》杂志上，第一作者为博士研究生谢西月。

利用具有氧化还原活性的介孔聚多巴胺纳米颗粒(MPDA)作为参比信号以及作为主体在介孔内负载电活性分子(Em)客体。以miRNA响应的单链DNA和G-四链体杂化DNA探针作为门禁分子通过PDA偶联封堵MPDA的介孔。由于miRNA触发的链置换反应(SDR)，导致设计的DNA门禁分子的响应性脱落以及负载的Em客体释放。采用差分脉冲伏安法(DPV)研究氧化还原主体MPDA/Em客体的参比信号/响应信号。以miRNA-21为模型，研究传感器的检测性能，包括灵敏度、选择性、重复性和实际应用。

【图文导读】

图1.基于miRNA响应的DNA门禁分子封堵的氧化还原主客体纳米传感器免固载比率电化学检测示意图。

图2. MPDA的 (a) TEM和 (b) SEM图像。(c) 不同扫描速率(50-400 mV s^-1)下MPDA悬浮液(40 μg mL^-1)的CV曲线和 (d) MPDA氧化峰电流(0.42 V)随扫速的曲线变化图。(e) MPDA作为氧化还原指示剂的电化学氧化过程。(f) 不同浓度(20-40 μg mL^-1) MPDA悬浮液中邻苯二酚含量和0.34 V下的DPV电流。(g)传统固载策略：ⅰ:MPDA滴涂修饰ITO电极的光学显微镜图像和ⅱ:SEM图像。ⅲ:具有有限探针-电极可及性和非均匀界面的传统固载电化学策略的构建示意图。ⅳ:固载MPDA电极的DPV信号(20批)。(h)免固载策略：ⅰ:MPDA的Zeta电位。ⅱ:所提出的免固载电化学策略中电场驱动的定向迁移和电子转移原理图。ⅲ:DPV信号(20批次)MPDA悬液(40 μg mL^-1)。

图3. (a) MPDA的固体紫外-可见-近红外 (UV-vis-NIR) 吸收光谱。(b) MPDA的CV曲线。(c) MPDA的UPS紫外光电子能谱。(d) MPDA的能级带隙和光致载流子分离示意图。(e) 不同浓度MPDA悬浮液的vis-NIR吸收光谱 ((25, 40, 75, 100, 150,和200 μg mL-1))。(f)质量摩尔吸光系数。(g)无光照和光照下MPDA的Mott-stocky图。(h) 无光照和光照下MPDA的EIS阻抗谱图。(i) NIR光照下MPDA光生电子界面转移的示意图。

图4. 不同光照功率下 (0, 0.2, 0.85, and 1.5 W cm^-2) MPDA悬浮液的(a) LSV曲线和(b) ABPE图。 (c) 瞬时NIR光照下MPDA的LSV曲线。(d) 不同光照功率下 (0.2-2.1 W cm^-2) MPDA的i-t曲线。(e) 不同光照功率下MPDA的IPCE曲线。(f)不同浓度MPDA悬浮液的质量电流强度。(g)不同光照功率下MPDA的DPV曲线。(h) MPDA在32.6 °C下 (水浴加热4 分钟) 的DPV曲线。

图5. (a)Em (Fc/MB/CA) 的分子结构式和相应电化学氧化反应。 (b) 不同Em、MPDA和MPDA-NIR的DPV曲线。 (c) Em的装载和释放示意图。(d) 不同pH条件(pH 5/7/8)下Em的装载效率。(e) Em的吸附动力学。(f) Em@MPDA在不同pH条件 (pH 5/7/8) 下4 h累计释放量。g) Em@MPDA (pH 7)随时间变化Em的释放曲线。

图6. (a)miRNA响应的杂交DNA门禁分子的制备示意图。 (b) 门禁分子的圆二色光谱。 (c) DNA门禁分子的形成和miRNA响应过程的凝胶电泳图。(d) 修饰DNA门禁分子的MPDA的X射线光电子能谱。(e) MPDA修饰DNA门禁分子后上清液紫外吸收光谱。(f) miRNA-21存在下荧光修饰门禁分子的响应释放示意图。g) 在miRNA-21触发DNA门禁分子释放下，上清荧光强度的变化。

图7. (a) miRNA-2固载传感平台的重现性。(b)免固载比率电化学纳米传感器在近红外照射下的定向迁移和电化学检测过程示意图。(c)近红外照射和非近红外照射下miRNA-21检测的DPV图。(d) 加入不同浓度miRNA-21后的DPV响应。(e)双信号氧化还原传感器的DPV电流强度比(I_CA/I_MPDA)与miRNA-21浓度的线性图。(f) 免固载纳米传感器的可重复性。(g) I_CA/I_MPDA随免固载策略(黑色)和固载策略(灰色)重复检测次数的变化曲线。(h)纳米传感器对混合物的特异性研究。（i) 主客体电化学纳米传感器对不同miRNA-21血清样品的加标回收检测。

【小结】

  本研究通过整合氧化还原多孔组装主客体和miRNA响应DNA门禁分子，成功开发了一种免固载比率电化学检测策略。该策略解决了靶标-探针和探针-电极相互作用的不可及性以及检测的不可重复性问题。首先，电活性的介孔聚多巴胺主体可以通过π-π堆积作用装载大量的Em客体，以及安装DNA门禁分子来封闭孔隙。由miRNA触发的SDR驱动Em客体的可控释放可以有效提高目标物对探针的可及性，实现一对多转换，并介导电化学信号输出。此外，溶液中的外加电场可以驱动电活性主体/客体向电极的定向移动和接触过程中的界面电子转移，从而促进探针对电极的可及性，并促进分离电位下的可重复双信号。同时近红外光照介导的电子转移显著促进MPDA到工作电极的电子转移，并导致参比信号增加10倍。因此，该传感平台通过差分脉冲伏安法实现了低LOD （362 fM）和高重复性（RSD 3.8%）miRNA检测。综上所述，这项工作不仅展示了构建氧化还原主客体纳米组件在解决电化学生物传感的可及性和重复性问题方面的巨大潜力，而且也为开发下一代生物传感器提供了一种新的策略。

【原文链接】

https://doi.org/10.1002/smtd.202101072