【研究背景】

具活性氧(ROS)调节活性的纳米酶已广泛应用于抗肿瘤、抗菌以及再生医学等领域。然而，大部分纳米酶的活性都处于始终开启的状态，使得ROS生成不可控，带来炎症过渡激活以及慢性难愈创面等一系列问题。

本课题组开发了一种具有“协同增强 、耗散衰竭” 的ROS纳米发生器，用于肿瘤术后治疗，可防止肿瘤复发、细菌感染以及避免持续性炎症。以Supramolecular semiquinone radicals confined with DNAzymes for dissipative ROS generation and therapy为题发表在《Nano Today》杂志上，第一作者为为博士研究生王振强。

利用具有过氧化物酶(HRP)活性的G-四链体/血红素(GH)复合物作为超分子自由基主体，捕获多巴胺氧化过程中产生的含半醌自由基寡聚体，并通过空间位阻保护和增加电子离域程度稳定半醌自由基。多余的多巴胺继续氧化聚合，最终形成纳米片形貌。纳米片中半醌自由基可作为电子供体还原氧气生成过氧化氢，继而被GH复合物催化生成高氧化毒性的羟基自由基(•OH)，用于肿瘤术后治疗中防止肿瘤复发和细菌感染。由于级联效应以及动力学匹配效应，•OH产生具有耗散型的特点，可以避免持续性炎症的发生以及促进伤口愈合。

【图文导读】

图1. GH-PDANSs纳米片的合成机理(a)以及GH-PDANSs耗散型产生•OH用于ROS治疗示意图(b)。

图2. GH-PDANSs的表征。G4s和GH复合物的圆二色谱(a)，PDANs透射电镜图片，(c) H-PDANs透射电镜图片，GH-PDANSs的高分辨透射电镜图片(d)、扫描透射电子显微镜高角环形暗场像以及相应的元素面扫描图(e)，GH-PDANSs的原子力显微镜图片(f) 以及选定纳米片上基于蓝色直线的高度分布曲线图(g)，图f中选定纳米片上白色方框内的高分辨原子力显微镜图片(h) 以及选定纳米片上基于蓝色直线的高度分布曲线图(i)，GH-PDANSs合成过程中2 h中间产物的扫描透射电子显微镜高角环形暗场像(j) 以及原子力显微镜图片(k)，GH-PDANSs的拉曼光谱图(l)。

图3. GH复合物与半醌自由基主客体相互作用研究。PDANs、H-PDANs以及GH-PDANSs 反应合成液的电子顺磁共振谱图(a)，多巴胺氧化自聚合的化学反应步骤(b)，PDANs、H-PDANs以及GH-PDANSs修饰玻碳电极的循环伏安曲线(c)，PDANs、H-PDANs以及GH-PDANSs 合成产物的X射线光电子能谱O 1s高分辨图谱(d)，GH-PDANSs的合成及结构示意图(e)。

图4. GH-PDANSs级联催化性能研究。使用H₂O₂检测试剂盒测量GH-PDANSs产生H₂O₂的操作示意图(a)，PDANs、H-PDANs 以及GH-PDANSs修饰玻碳电极的恒流放电曲线(b)，ABTS溶液(1.6 mM)中加入不同HRP仿酶后的420 nm处吸光值变化(c)，级联反应原理示意图(d)，TA溶液(0.5 mM)中加入不同质量GH-PDANSs后的荧光光谱图(e)以及425 nm荧光强度变化折线图(f)，GH-PDANSs, H-PDANs和PDANs分散液产生•OH的电子顺磁共振谱图(g)，GH-PDANSs对自身产生H₂O₂或外源加入H₂O₂的HRP仿酶催化活力(h)，通过级联反应活性判断GH-PDANSs的储存稳定性(i)，GH-PDANSs产•OH的可重复性研究(j)。

图5. 体外肿瘤细胞抑制效果评价。GH-PDANSs抗肿瘤机理图(a)，4T1细胞与不同浓度GH-PDANSs共孵育(pH 6.5)后的细胞活力数值(b)，4T1细胞与不同材料孵育后的活死染色荧光显微镜图片(c)以及细胞活性数值(d)，4T1细胞与不同材料孵育后的凋亡情况(e)以及凋亡水平统计(f)，4T1细胞与GH-PDANSs (200 μg mL^-1)在不同气体环境中孵育后的细胞活力数值(g)。

图6. 防止肿瘤复发效果评估。肿瘤建模、肿瘤切除术和治疗时间线示意图(a)，不同治疗过程中小鼠照片以及肿瘤生长曲线(b)，治疗结束后各组肿瘤的照片(c)、施加不同剂量GH-PDANSs治疗过程中肿瘤体积变化(d)以及小鼠体重变化曲线(e)，各组肿瘤组织切片的H&E染色和TUNEL染色图片(f)，治疗结束后各组荷瘤小鼠主要脏器的病理学图像(g)，小鼠心功(h)以及肾功(i)评价。

图7. 纳米片抗菌性能及促伤口愈合评估。不同处理后金黄色葡萄球菌的平板照片(a)及抑菌率(b)，不同处理后金黄色葡萄球菌生物膜的结晶紫染色照片(c)，不同处理后细菌生物膜的活死染色荧光共聚焦显微镜图片(d)，空白水胶体敷料和 GH-PDANSs 敷料的光学照片和扫描电镜图(e)，感染伤口建模和治疗流程示意图(f)，接受不同治疗手段的小鼠感染伤口在不同时间的电子照片(g)以及伤口面积统计(h)，伤口组织切片的 Giemsa 染色、Masson 三色染色以及H&E 染色光学显微镜图片(i)。

图8. 体外及体内免疫调节评估。生理盐水、GH复合物+ H₂O₂ (20 μg mL^-1, 0.4 mM)或GH-PDANSs (200 μg mL^-1)处理后的RAW264.7细胞中ROS染色共聚焦显微镜图片(a)、流式细胞术数据(b)以及荧光强度变化曲线(c)，GH-PDANSs避免长期炎症的机制示意图(d)，不同材料处理后细胞中促炎症细胞因子（TNF-α和IL-1β）和抗炎性细胞因子（Arg-1和IL-10）的mRNA表达水平(e)，不同材料处理后手术部位ROS含量随时间变化的小动物荧光成像图(f)，单次治疗4天后伤口皮肤组织石蜡切片的免疫组化染色(g)。

【小结】

本研究利用G-四链体核酸与PDA寡聚体的主客体相互作用，制备了耗散型ROS纳米发生器。GH复合物通过π-π堆积和增加自由基电子离域空间稳定半醌自由基，使半醌自由基氧化峰位移510 mV，使O-C键含量增加了35%-48%。GH-PDANSs可以在N₂饱和水中稳定储存，20天时产ROS性能仅下降7%，60天时能保留45%的产ROS效率。病理酸性微环境中有效产生ROS，发挥抗肿瘤复发及细菌感染的功能。10 mg kg^-1的注射剂量可达90%的抗肿瘤复发效果，且施加22 h后不再生成ROS，防止了持续性炎症，显著消除伤口感染及促进伤口修复。

【原文链接】

https://doi.org/10.1016/j.nantod.2022.101402