•      在本研究中我们首次发现，NEP和IDE在CD206阴性和iNOS阳性的M1小胶质细胞中低表达，而在CD206阳性和iNOS阴性的M2小胶质细胞中高表达，这可能是诱导Aβ减少的主要表型。我们也首次发现柚皮素是第一种通过促进M2小胶质细胞极化而增加Aβ降解酶NEP和IDE表达的化合物，从而诱导Aβ斑块减少，这表明柚皮素将是干预AD的候选药物，该成果于2019年2月15日在线发表在Phytotherapy Research杂志上。具体研究内容如下：

1. 柚皮素对正常小胶质细胞的极化作用：将原代培养的小胶质细胞接种于8 孔板上（1.5*10⁴ cells/well），1 h后分别加入空白对照（DMSO），阳性对照（IL-4）和骨碎补入脑成分柚皮素，培养24 h 后，免疫细胞染色发现柚皮素能够显著升高CD206 (1:200, M2 marker)阳性M2小胶质细胞和降低iNOS (1:50, M1 marker)阳性M1小胶质细胞。

2. 柚皮素对Aβ诱导的小胶质细胞的极化作用：将原代培养的小胶质细胞接种于8 孔板上（1.5*10⁴ cells/well），2 h后分别加入Aβ 24 h，后除去含Aβ的上清，加入空白对照（DMSO），阳性对照（IL-4）和骨碎补入脑成分柚皮素，培养24 h 后，免疫细胞染色发现柚皮素能够显著升高CD206 (1:200, M2 marker)阳性M2小胶质细胞和降低iNOS (1:50, M1 marker)阳性M1小胶质细胞。

3. 柚皮素激活小胶质细胞对Aβ的吞噬作用：原代培养的小胶质细胞接种于8 孔板上（1.5*10⁴ cells/well），1 h后加入柚皮素（0.1-100 uM）或阳性对照IL4，培养4 h后加入Aβ1-42继续培养24 h，后除去含Aβ和柚皮素的上清，加入Aβ1-42 Hilyte Fluor 488，培养3 h 后，4% PFA 固定细胞，加入一次抗体CD206 (1:200, M2 marker)或iNOS (1:50, M1 marker)和二次抗体Alexa Fluor 594 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)。结果发现加入Aβ1-42后，小胶质细胞对荧光标记的Aβ1-42 Hilyte Fluor 488的吞噬能力大大增加，但随着柚皮素浓度的增加，含荧光标记Aβ1-42 的CD206阳性小胶质细胞的数量明显减少而iNOS阳性小胶质细胞数量不变，结果可能提示柚皮素的加入激活了M2型小胶质细胞的数量，从而高表达了Aβ降解酶，对外源性异物进行降解，而M1型小胶质细胞的降解作用较弱。

4. 柚皮素对小胶质细胞Aβ降解酶IDE和NEP表达的影响：原代培养的小胶质细胞接种于8 孔板上（1.5*10⁴ cells/well），1 h后加入柚皮素（0.1-100 uM）或阳性对照IL4，继续培养24 h后，4% PFA 固定细胞，加入一次抗体Arginase I (1:500, M2 marker)或CD16/32 (1:50, M1 marker)和二次抗体Alexa Fluor 594和488 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)进行免疫荧光染色，使用荧光显微镜(BX-61/DP70, Olympus)照相并用Metamorph 软件进行图像解析。结果发现胰岛素降解酶IDE主要在M2型小胶质细胞中表达，而在M1型小胶质细胞中的表达较少，IL4和柚皮素（50和100 uM）能够增加高表达IDE的M2细胞，而降低高表达IDE的M1细胞的数量；同样，Neprilysin (NEP)也主要在M2型小胶质细胞中表达，而在M1型小胶质细胞中的表达较少，IL4和柚皮素（50和100 uM）能够增加高表达NEP的M2细胞，而降低高表达NEP的M1细胞的数量。该结果证实了柚皮素是通过增加M2型小胶质细胞的极化，从而增加Aβ降解酶IDE和NEP的表达，起到Aβ降解的作用。

    综上，研究发现柚皮素能够促进M2型小胶质细胞增加并降低M1型小胶质细胞，柚皮素促进小胶质细胞对Aβ的吞噬并通过增加降解酶IDE和NEP来促进其降解。