2023年8月17日，Cell Press旗下杂志iScience以《Structural characterization of an isocytosine-specific deaminase VCZ reveals its application potential in the anti-cancer therapy》在线发表了课题组最新研究成果。课题组硕士生郭文婷，已经毕业研究生李晓嘉，博士生李鸿炜，以及浙江大学硕士研究生范静语为文章的共同第一作者。浙江大学杜雨棽研究员及中山大学吴柏星为文章共同通讯作者。

基因导向酶前体药物治疗(Gene-directed enzyme prodrug therapy, GDEPT)是目前最成功的药物递送和肿瘤治疗方法之一。在转基因方法中，一种编码特定酶的基因被设计成含有肿瘤特异性启动子的载体携带，该启动子可以在肿瘤细胞中特异性表达。表达的酶将无活性的前药进一步分解代谢为细胞毒性药物，抑制肿瘤细胞生长，促进其死亡。理想的酶应具有较高的催化活性和特异性；同时，前体药物必须是无毒或极低毒性的，但分解代谢产物对肿瘤细胞具有高度毒性且半衰期较长。高“旁观者效应”(即未转染细胞因邻近转染细胞的间接效应而死亡)也是分解代谢产物放大对肿瘤细胞影响所必需的，从而导致更广泛的肿瘤细胞死亡。这些标准是减少给药剂量和避免对正常细胞造成不必要损伤的先决条件。

在癌症治疗中广泛使用的化疗试剂5-氟尿嘧啶(5-FU)也可以由低毒性的前体药物5-氟胞嘧啶(5-FC)通过胞嘧啶脱氨酶(CD)蛋白生成。肿瘤细胞中的5-FU可以催化生成5-氟脱氧尿嘧啶核苷5'-单磷酸(5-FDUMP)、5-氟脱氧尿嘧啶核苷5'-三磷酸(5- FDUTP)和5-氟尿嘧啶核苷5'-三磷酸(5-FUTP)，这些嘧啶类抗代谢产物会抑制胸腺嘧啶合酶或错误地掺入RNA和DNA，从而导致肿瘤细胞死亡。酰胺基水解酶(CDs)属于酰胺基水解酶超家族，通过螯合一或两种二价金属，催化胞嘧啶生成尿嘧啶。CDs主要存在于细菌和真菌中，但未在哺乳动物细胞中发现，这使其成为将无害底物5-FC转化为细胞毒性产物5-FU的理想酶。然而，肠道菌群胞嘧啶脱氨酶也可以催化5-FC产生不期望的5-FU，从而对生物体产生有害影响。

异胞嘧啶(又名2-氨基尿嘧啶)是胞嘧啶的异构体，是一种非天然的核苷，通常用于研究不同核碱基之间氢键的形成。最近，基于宏基因组文库的研究发现了4种可能的异胞嘧啶脱氨酶(ICD)，它们可以特异性地将异胞嘧啶转化为尿嘧啶，包括VCZ、URA3、URA4和KANOS 。系统进化分析表明，这些蛋白属于两个类群;KANOS与经典的CD(如来自大肠杆菌的CodA)相似，可以催化异胞嘧啶和胞嘧啶，而其他三个蛋白与8-羟基鸟嘌呤(8-oxo-G)脱氨酶密切相关，8-oxo-G脱氨酶的代表蛋白来自马尾藻海的环境样本。体外和体内实验表明，URA3和VCZ能够将异胞嘧啶而非胞嘧啶转化为尿嘧啶，以及5-氟异胞嘧啶(5-FIC)转化为5-FU，表明VCZ/5-FIC有潜力成为一种新的酶/前药系统用于肿瘤治疗。然而，VCZ和URA3是如何催化异胞嘧啶形成尿嘧啶的，以及CD和ICD之间的异同尚不清楚。

在本研究中，我们对异胞嘧啶特异性脱氨酶VCZ进行了结构研究，以剖析其与异胞嘧啶的结合和催化特性，并评估其在人源结直肠癌细胞系中的治疗效果。我们的研究揭示了Zn2+结合位点和参与特定异胞嘧啶底物结合和催化的关键残基。我们进一步说明了VCZ与经典胞嘧啶脱氨酶的区别。此外，我们捕获了对底物进入和产物释放至关重要的关键残基的构象变化，从而推动我们提出了VCZ作为异胞嘧啶特异性脱氨酶的反应方案。由于异胞嘧啶的非天然性质和5-FIC的无毒性质，我们对VCZ的研究将为ICD/5-FIC酶/前药对的工程优化研究提供思路，以确保其在临床试验中的安全性和有效性。

然而，与我们体外脱氨酶实验中的异胞嘧啶相比，VCZ对5-FIC底物的催化活性约为80%;因此，在不影响5-FIC底物选择性的前提下，仍需要更多的VCZ有益突变来提高其对底物的活性。分子动力学模拟研究有助于了解VCZ的动态行为，预测突变对蛋白质结构和功能的影响，从而提高VCZ对5-FIC的催化活性，以及ICD/5-FIC对在临床试验中的应用潜力。此外，虽然我们测试了VCZ/5-FIC的作用，并揭示了5-FIC的无害特性，这与之前的研究一致，以及药物对HCT116和CT26细胞系的高旁观者效应，但根据我们的观察，CT26细胞系比HCT116细胞系对VCZ/5-FIC更敏感。需要更多的实验来评估VCZ/5-FIC对在不同肿瘤细胞系和小鼠模型中的应用，以获得更多关于该酶/前药对的作用信息，为进一步的临床试验提供更多的信息。

最后，5-FU可以转化为几种活性代谢物，包括FdUMP、FdUTP和FUTP;给药的5-FU可以被二氢嘧啶脱氢酶分解为二氢氟尿嘧啶(DHFU）。更多的无害的异胞嘧啶衍生物有待开发，以提高前体药物的稳定性，并产生有效的5-FU模拟物来实现抗肿瘤功能。我们的研究为优化VCZ/5-FIC酶/前药对以稳定5-FU产物和提高肿瘤治疗的反应率提供了新的思路。

原文链接：https://www.cell.com/iscience/fulltext/S2589-0042(23)01749-2#secsectitle0015

本项目得到国家自然科学基金(31900435,82272300，82102893,82060458，ZRKX2018000153),广东省科技厅(2020B1212060018，2020B1212030004)，中山大学青年教师培育计划(23PTPY42)等基金的支持。