题目：基于纳米酶和双功能纳米抗体的比色SERS双模免疫传感器检测微囊藻毒素-LR
期刊： Food Chemistry
影响因子：8.5
原文链接：Nanozyme and bifunctional nanobody-based colorimetric-SERS dual-mode Immunosensor for microcystin-LR detection - ScienceDirect
汇报人：葛广晟-2024级硕士
微囊藻毒素LR（MC-LR）是淡水中的一种强效蓝藻毒素，具有造成严重肝损伤和其他健康问题的风险，因此检测至关重要。然而，传统抗体的检测能力有限，这减少了它们在免疫测定中的应用。本研究设计了一种新的双功能纳米抗体，名为A2.3-SBP（由纳米抗体和链霉亲和素结合肽组成），能够与MC-LR和链霉亲和素结合。基于A2.3-SBP和Fe3O4@Au-Pt我们介绍了一种无酶免疫传感器，该传感器在微孔板中以比色和表面增强拉曼散射（SERS）检测模式运行。双模分析显示，颜色变化和SERS强度与MC-LR浓度直接相关，范围分别为1.0至500 ng/mL，检测限分别为0.26和0.032 ng/mL。该方法消除了对复杂酶反应的需要，并在30分钟内实现了96个水样（0.03μg/kg）中MC-LR的双信号检测，表明其在饮用水检测中的潜力。
微囊藻毒素 （MC） 是蓝藻产生的一组次生代谢物，在有害藻华发生期间经常在营养丰富的水生环境中增殖。它们强大的肝毒性可以抑制细胞蛋白磷酸酶，导致蛋白质过度磷酸化，并可能促进代谢紊乱和肿瘤发生。在 MC 的 80 多种已鉴定亚型中，MC-LR 是一种普遍且剧毒的变体，表现出类似于有机磷酸盐神经毒剂的急性毒性。人类急性暴露于 MC 会导致胃肠道不适和肝脏炎症，而慢性暴露与肿瘤发展、肝功能衰竭的风险增加有关，严重时还会导致死亡。当 MC-LR 的暴露剂量超过通常来自动物实验的既定安全阈值时，长时间摄入会显着增加肝损伤和肿瘤发生的风险。
为确保食品安全，许多国家都确定了食品中 MC-LR 的最高允许水平。世界卫生组织 （WHO） 将饮用水中 MC-LR 的指导值为 1 μg/L，这是许多国家在制定法规时采用的标准。同样，欧盟 （EU） 颁布了有关 MC-LR 水平的立法。值得注意的是，欧盟饮用水指令规定饮用水中总 MC 含量的限值为 1 μg/L。这些监管措施强调了 MC-LR 构成的重大健康风险，并强调了全球卫生组织和监管机构在保护公众健康方面的重要性。
荧光探针和基于适配体的方法等新兴技术有望实现快速灵敏的检测，但它们仍然需要进一步开发和验证，以确保可靠性和有效性。虽然个别技术可能会遇到灵敏度低、稳定性和可重复性差的限制，但迫切需要快速且经济可行的创新方法。与单一技术相比，技术集成两种或多种分析技术的组合具有多种优势，从环境监测到食品污染物筛查，在各种应用中可能是一种很有前途的替代方案。Fe 3O4@Au-Pt的整合进入免疫传感器方案表明在提高检测性能方面取得了巨大进展。Fe 3O4@Au-Pt的酶活性和磁性的应用不仅减少了检测程序，还降低了假阳性的风险，从而提高了分析结果的准确性和可靠性。
1.A2.3-SBP 融合蛋白的鉴定
（A） MC-LR-BSA抗原偶联过程与烯烃加氢硫代改性方法的示意图。（B） A2.3-SBP融合蛋白的SDS-PAGE（左）和Western blot（右）分析。泳道1和2：Ni-NTA亲和纯化的A2.3-SBP融合，泳道M：预存蛋白梯（8-180kDa）。红色箭头指向A2.3-SBP融合蛋白；（C） BSA和MC-LR-BSA的质谱分析，其峰对应于BSA（MW=66437.991）和MC-LR-FSA（67835.714）的平均分子量。
2.MAP@Ab探针的表征
（A）Fe3O4 MNP的TEM图像（B）Fe3O4@SiO2（C）MS@Au-Pt（MAP）（D）MAP的放大版本（E）MAP@Ab探头。（F）MAP@Ab与MC-LR-BSA结合的SEM图像。
3.比色-SERS 免疫传感器的验证
（A） MAP-NZ在比色SERS检测中具有过氧化物酶和氧化酶催化活性的可能机制。（B） 使用不同MC-LR浓度的免疫测定MAP@Ab探针（a:0，b:50 ng/mL，c:100 ng/mL），并用H2SO4终止。（C）不同成分的oxTMB的SERS检测（a:TMB，b:TMB+Au NP，C:TMB+MAP NZ，d:TMB+MAP NZ+Au NP）。
4.比色-SERS 方法的优化
（A） 不同Au NP的紫外-可见光谱（Au NPs-1#和Au NPs-2#：用NaBH4还原；Au NPs-3#和Au NPT-4#：用柠檬酸钠还原）。（B） Au NPs-4#（25nm）的TEM图像。探索以下实验条件：（C）着色时间，（D）不同尺寸的Au NP（Au NPs-1#，10nm；Au NPs-2#，15nm；Au NPs-3#，20nm；Au NP-4#，25nm），（E）Au NP浓度（Au NPs-4#，0.25、0.5、1、2和4mg/mL），（F）与Au NP的孵育时间（Au NPs-4#，0、5、10、15、20、25和30分钟）。
5.MC-LR 的定量检测
（A） 使用比色法测定0.1至500 ng/mL不同浓度MC-LR的响应曲线。（B） 450nm处的吸光度值与MC-LR浓度的关系图（插图为对数变换的校准曲线）。（C） SERS法测定0.1至500 ng/mL不同MC-LR浓度的响应曲线。（D） 1610 cm-1处的拉曼强度与MC-LR浓度的关系图（插图是具有对数变换的校准曲线）。（E） 不同浓度（0、0.1和1 ng/mL）下平板孔中随机选取的10个点的1610 cm-1 SERS信号强度（同一时间段的每个光谱是15次采集的平均值）。（F） SERS检测标准化强度（10 ng/mL）的MC-LR、CYN、MC-LW、MC-YR、MC-RR（各为100 ng/mL的浓度）和等体积的混合样品（MC-LR、CYP、MC-LV、MC-YR、MC-RR的混合物）的交叉反应性。误差条是根据至少三次测量的标准偏差计算的。
本研究通过开发双功能纳米体A2.3-SBP，在检测MC-LR方面取得了突破性进展。基于A2.3-SBP和MAP-NZ，建立了一种新的无酶免疫传感器，用于比色和SERS检测。双模式分析表现出较宽的检测范围和极低的检出限，比色法为0.26 ng/mL，SERS法为0.032 ng/mL。这不仅通过证实的比色和SERS信号提高了检测可靠性，而且消除了对复杂酶反应的需求。此外，双模方法通过实际样品进一步验证，与HPLC-MS结果具有良好的一致性，进一步揭示了其出色的准确性、再现性和特异性。该方法的简单性和稳健性使其成为一种有前景的即时检测和环境监测工具，为保护公共健康和食品安全做出了重大贡献。