题目：纳米抗体与葡萄球菌肠毒素B结合的结构见解

期刊：International Journal of Biological Macromolecules

影响因子：7.7

原文链接：Structural insights into the binding of nanobodies to the Staphylococcal enterotoxin B - ScienceDirect

汇报人：范雪一-2024级硕士

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）产生的B型肠毒素（SEB）以引起严重食物中毒和中毒性休克综合征而闻名。虽然基于纳米抗体的治疗方法有望对抗SEB引起的疾病，但缺乏SEB和纳米抗体之间的结构信息阻碍了基于纳米抗体的治疗方法的发展。在这里，我们展示了SEB-Nb3、SEB-Nb6、SEB-Nb8、SEB-Nb11和SEB-Nb20的晶体结构，分辨率范围从1.59 Å到2.33 Å。晶体学分析显示，Nb3、Nb8、Nb11和Nb20在t细胞受体（TCR）界面与SEB结合，而Nb6在主要组织相容性复合体（MHC）界面结合，表明它们可能通过破坏与TCR或MHC分子的相互作用来抑制SEB的功能。分子生物学分析证实了Nb3、Nb5、Nb6、Nb8、Nb11、Nb15、Nb18和Nb20对SEB的热力学和动力学参数。通过纳米抗体中和的细胞实验进一步证实了竞争性抑制。这些发现阐明了开发特异性纳米抗体来中和SEB威胁的结构基础，为潜在机制提供了重要的见解，并为进一步优化未来的治疗策略提供了重要的帮助。

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种革兰氏阳性细菌，通常存在于人类和动物的皮肤和鼻道中，在已鉴定的20多种se中，葡萄球菌肠毒素B型（SEB）因其优异的热稳定性和对蛋白酶的抗性而成为一种典型的毒素。SEB通过与T淋巴细胞中的T细胞受体（TCR）的β链和抗原呈递细胞上的主要组织相容性复合体（MHC）分子结合，绕过免疫细胞典型的抗原特异性激活限制。这种失调的免疫反应导致T淋巴细胞的快速扩张和促炎细胞因子、趋化因子和组织因子的级联释放，最终导致各种人类疾病，如食物中毒、皮肤感染、咽炎、急性肺损伤和中毒性休克综合征。SEB的常规治疗方法包括静脉注射免疫球蛋白以抵消其毒性。然而，由于抗体的复杂组成和免疫球蛋白缺乏特异性，这种治疗方式的疗效仍然不一致。目前，尚无批准的针对SEB的特异性治疗方法。鉴于抗体是SEB的主要天然对抗剂，针对直接中和SEB的基于抗体的治疗在暴露的初始阶段最有效，在T淋巴细胞激活和随后释放促炎细胞因子、趋化因子和组织因子之前。研究强调了靶向SEB抗体的高疗效在体内中和毒性，从而为靶向SEB抗体治疗的临床研究奠定基础。

纳米抗体作为能够结合靶抗原的最小单位而脱颖而出，同时保持了非常高的亲和力。利用其互补性决定区域（cdr），包括CDR1、CDR2和CDR3，再加上它们的低分子量，纳米抗体表现出识别不同表位的卓越能力。此外，它们紧凑的尺寸使它们能够穿过血脑屏障，扩大了药物递送策略的范围。值得注意的是，纳米抗体在原核系统中的表达能力优于传统抗体，具有优越的稳定性。这些特性使得纳米抗体在各种应用中不可或缺，从体外诊断到临床治疗，同时保持成本效益。

虽然针对SEB的抗体研究已经取得了初步进展，但对纳米抗体与SEB相互作用的研究仍然相对有限，我们的研究旨在通过确定这些纳米抗体与SEB结合的晶体结构来解决这一空白。此外，我们还研究了纳米抗体的生化特性。特别值得注意的是，Nb6表现出了显著的中和效果，这可能源于其表位的独特特征和特别大的结合界面。本文的研究结果不仅扩展了纳米抗体-SEB相互作用的结构库，而且有望推进基于纳米抗体的SEB检测和治疗干预。

1.靶向葡萄球菌肠毒素B不同表位的纳米抗体

Fig. 1

图1所示。用x射线晶体学测定seb -纳米抗体复合物的结构。A. SEB-Nb3/Nb6/Nb8/Nb11/Nb20复合物的整体结构。SEB显示为橙色，Nb3显示为灰色（PDB ID:8YBL）， Nb6显示为黄色（PDB ID:8YBM）， Nb8显示为紫色（PDB ID: 8YBN）， Nb11显示为粉红色（PDB ID: 8YBO）， Nb20显示为浅绿色（PDB ID: 8YBP）， CDR1-3显示为蓝色，绿色和红色。B. Nb3（灰色）-SEB、Nb6（黄色）-SEB、Nb8（紫色）-SEB、Nb11（粉色）-SEB和Nb20（浅绿色）-SEB复合物的比对。C.Nb3、Nb6、Nb8、Nb11、Nb20的表面电位比较（蓝色区域为正电荷面，红色区域为负电荷面）。

Fig. 2

图2所示。纳米抗体与SEB的详细结合界面。模拟。SEB-Nb3、SEB-Nb8、SEB-Nb11、SEB-Nb20接口概述。SEB显示为橙色。Nb3为灰色，Nb6为黄色，Nb8为紫色，Nb11为粉红色，Nb20为浅绿色，CDR1-3为蓝色，绿色和红色。黄色虚线表示氢键和盐键，关键残基用彩色棒表示.

Fig. 3

图3所示。Nb6与SEB的详细绑定接口。SEB蛋白含有两个纳米抗体Nb6的结合表位，可以同时与两种SEB蛋白结合。SEB显示为橙色。Nb6用黄色表示，CDR1-3 s用蓝色、绿色和红色表示。黄色虚线表示氢键和盐键，关键残基用彩色棒表示。

2.SEB与纳米抗体的结合动力学

Fig. 4

图4所示。用表面等离子体共振（SPR）验证纳米抗体与SEB相互作用。A-H.SEB-Nb3、SEB-Nb5、SEB – Nb6、SEB-Nb8、SEB-Nb11、SEB-Nb15、SEB-Nb18、SEB-Nb20接口概述图中x轴表示时间(s)， y轴表示响应单位（RU），表示纳米抗体与SEB相互作用的强度。

Fig. 5

图5所示。用ITC验证纳米抗体与SEB的相互作用。A-H. 原始热像图（上图）和结合等温线（下图）。上面面板的x轴表示时间，而y轴表示样品单元和参考单元之间的差分功率（DP）。下面板的x轴表示摩尔比，y轴表示注射器内卡路里的摩尔变化。点为实验所得数据，线为拟合曲线。

3.用FSEC分析seb -纳米抗体相互作用的表位

Fig. 6

图6所示。基于荧光的尺寸排除色谱（F-SEC）分析证实了纳米抗体与不同表位结合形成不同的大分子复合物。A.有或没有Nb3/6/5/8/11/15/18/20的SEB的FSEC概况。B. SEB和SEB-Nb复合物14 mL - 20 mL范围的特写图。C.添加或不添加Nb3/5/8/11/15/18/20的SEB-Nb6的FSEC概况。D.添加或不添加Nb3/5/8/11/ 15/18/20的SEB-Nb6的14 mL - 20 mL范围的特写视图。

4.纳米抗体对seb诱导炎症反应影响的体外研究

图7所示。SEB和纳米抗体处理后IL-2表达水平。用2 μM纳米抗体对人pbmc进行预处理1 h，然后与2 μM SEB共孵育。同时，将SEB或纳米抗体单独处理的细胞作为对照。收集人PBMCs上清液，ELISA检测IL-2的表达。结果显示合并数据与三个独立的测量，n = 3。统计分析采用平均标准差的单因素方差分析（SEM）。(* p < 0.05, * * * * * p < 0.01, p < 0.001, * * * * p < 0.0001)

5.Nb竞争性抑制MHC和TCR结合的潜在机制

Fig. 8

图8所示。Nb3、Nb6、Nb8、NB11、Nb20、TCR和MCH在SEB周围的空间位置。A & B. SEB-Nb3、SEB-Nb6、SEB-Nb8、SEB-Nb11、SEB-Nb 20、SEB-TCR （PDB ID:1SEB）和SEB-MHC （PDB ID:1SEB）的比对。SEB为橙色，TCR为浅紫色，MHC为紫红色。Nb3为灰色，Nb6为黄色，Nb8为紫色，Nb11为粉红色，Nb20为浅绿色，CDR1-3为蓝色，绿色和红色。C. TCR、MHC和纳米抗体在SEB上结合位点的比较。SEB用橙色表示，TCR用淡紫色表示，MHC用紫红色表示，Nb3用灰色表示，Nb6用黄色表示，Nb8用紫色表示，Nb11用粉色表示，Nb20用浅绿色表示，CDR1-3 s用蓝色、绿色和红色表示。

在这项研究中，我们阐明了纳米抗体Nb3、Nb6、Nb8、Nb11和Nb20如何与葡萄球菌肠毒素B （SEB）抗原上不同的表位结合的原子水平细节，提供了以前未解决的结构见解。通过系统分析SEB与纳米抗体之间的相互作用，并辅以分子生物学表征，我们验证了SEB与纳米抗体的结合表位，并量化了SEB与Nb3、Nb5、Nb6、Nb8、Nb11、Nb15、Nb18和Nb20的亲和参数。Nb6识别的表位与SEB上的MHC结合位点重叠，而Nb3、Nb5、Nb8和Nb20的表位与TCR结合区重叠。值得注意的是，Nb6可以与Nb3、Nb5、Nb8或Nb20同时结合SEB，因为它们的表位不重叠。本文提供的高分辨率结构和结合数据可能有助于合理设计和开发针对SEB的特异性抑制剂，SEB是一种与中毒性休克综合征和其他疾病有关的强效细菌超抗原。