题目：基于合成纳米抗体库生成香豆磷纳米抗体的新策略

期刊：Food Chemistry

影响因子：8.5

原文链接：A new strategy to generate nanobodies for the coumaphos based on the synthesized nanobody libraries - ScienceDirect

汇报人：王梦楠-2024级-硕士

为了突破化学污染物纳米抗体制备中由于免疫原合成困难、复杂和难以预期的免疫效率而导致的瓶颈，采用了一种基于设计的合成纳米抗体库生成纳米抗体的新策略，最终大小可达109 cfu/mL，并成功筛选出抗香豆磷纳米抗体A4。此外，从二级文库中获得了一个亲和成熟突变体Nb3G。最后建立了ic-ELISA，对香豆磷的检测限为1.90 ng/mL，比亲本NbA4提高了6.4倍，检测范围为3.06~15.77 ng/mL。蔬菜样品的回收率为89.9% ~ 98.5%。最后，通过标准UPLC-MS/MS方法验证了该方法的准确性，R²达0.99。总的来说，在这项工作中构建的完全合成的Nb库为生成针对化学污染物的特定Nb提供了另一种可能性。

基于抗原和抗体特异性识别的免疫分析方法简单、成本低，在快速检测农产品中存在的化学污染物方面具有优势。显然，针对靶点的特异性抗体是免疫分析的核心试剂，在免疫分析中起着最重要的作用。与传统抗体如多克隆抗体（PAbs）、单克隆抗体（MAbs)）或重组单链可变片段（scFvs）或抗原结合片段（Fabs）相比，骆驼单域重链抗体，也称为纳米抗体（Nbs），不仅具有高灵敏度，而且具有良好的稳定性，甚至对有机溶剂具有良好的耐受性。此外，作为一种工程抗体，Nb可在大肠杆菌中高效表达，产率可达10 ~ 100mg /L，通过分子进化更容易进行亲和成熟，因此在免疫分析领域受到越来越多的关注。目前，针对靶点生成特异性Nb的一般策略是通过表面显示技术（噬菌体、酵母或核糖体）基于免疫文库生成特异性Nb。到目前为止，已经制备了几种针对不同化学污染物的Nbs，如苯丙酸诺龙、非硝硫磷、丙烯酰胺，并用于建立快速检测方法。然而，对于化学污染物，从免疫文库中选择Nbs仍然存在许多局限性，包括免疫原合成困难、免疫工作复杂且效率难以预料、骆驼养殖不便且成本高、动物福利要求越来越严格等。因此，有必要开发一种绕过动物免疫的新策略来产生针对小分子靶点的Nbs。

毫无疑问，随着分子生物学技术和生物信息学技术的发展，合成抗体文库有望取代免疫文库。由于Nb结构简单，只有一条重链存在，因此更容易拼接和组装，与scFv或Fab相比，更容易将三个框架区（FRs）和三个互补决定区（CDRs）拼接和组装到全长cDNA文库中，而不会出现VH和VL的错误折叠。目前已经构建了以Nb cAbBCII-10 FRs为FR源和随机 CDRs的半合成Nb库或全合成Nb库。此外，为了减少合成抗体库中无效的Nbs，采用统计分析的策略，通过分析一个天然抗体库中250个Nbs的CDR序列，计算CDR的氨基酸数量以及每个位点的多样性，设计了人源化Nb噬菌体展示文库NaLi-H1。随后，成功筛选出4种特异性Nbs，分别对β-Actin、tubulin、EGFP和mCherry，亲和性甚至低至亚纳摩尔量级。同样，通过分析PDB数据库中的93个独特序列，设计了酵母表面的合成Nb库，最终用于选择人类 GPCRs的构象选择性Nbs。这些成功的案例表明，从理论上讲，合成的Nb库可能是生成化学污染物特异性Nb的一种可能策略。然而，用于制备半抗原物质Nbs的合成Nb库尚未见报道。

香豆磷是一种有机磷农药（OP），常用于畜牧业预防体外寄生虫。鉴于其神经毒性和对人体健康的潜在危害，在蔬菜和水果中设定了香豆磷的最大残留限量（MRL），范围为0.01至0.5 mg/kg(欧盟农药数据库）。到目前为止，关于香豆磷基于PAb或MAb的免疫分析的出版物很少。在这项工作中，利用并验证了一种新的策略，从合成的Nb库中生成香豆磷的特异性Nbs。根据收集到的不同半抗原物质的Nb序列的统计分析结果，设计并构建了不同长度随机CDRs 的合成Nb文库。此外，通过二级文库的构建和生物筛选，筛选了针对香豆磷的特异性Nbs，获得了亲和突变体。最后，建立了一种可靠的间接竞争性酶联免疫吸附法（ic-ELISA）

1.纳米抗体文库的设计与构建

Fig. 1

图1所示。合成库设计的序列基础。(A)收集的Nbs FR一致性序列与Nb cAbBCII-10的FR序列比对。通过使用Clustal Omega和Jalview对收集的Nbs FR上每个位点的氨基酸频率进行比对，得出一致的序列。(B)蛋白质亲水性（左）和聚集性（右）分析。蛋白质亲水性根据Kyte和Doolittle（1982）计算。使用Discovery Studio 2017软件计算蛋白质聚集。(C)收集的纳米抗体CDRs长度的统计分析。

Fig. 2

图2所示。12个合成Nb库的构建。(A)全长Nb基因文库构建策略示意图。(B)每轮PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。1-6号线（~100 bp）， FR1-CDR1, FR2-CDR2, FR3, CDR3-15aa- fr4, CDR3-18aa- fr4, CDR3-22aa- fr4, 7-10号线（~300 bp）， FR1-CDR2, FR3- fr4 -15aa, FR3- fr4 -18aa, FR3- fr4 -22aa, FR3- fr4 -22aa， 11-22号线（~400 bp）， cdr1 -22aa, cdr2 - 3-22aa, CDR1/3-22aa, cdr2 -18aa, CDR1/3-18aa, CDR3-18aa, cdr2 -15aa, CDR1/3-18aa, CDR3-18aa, CDR3-15aa, cdr2 -15aa, CDR1/3-15aa, CDR3-15aa。(C)随机化不同CDR组合得到的12个合成Nb文库方案。

2.从合成库中选择抗香豆磷Nbs

Fig. 3

图3所示。抗香豆磷Nbs的选择。(A) 45个克隆的PE-ELISA鉴定。(B)阳性Nbs序列。(C) ic-ELISA法检测Nb A4和Nb YA7的灵敏度（n = 3）。

3.增强Nb突变体灵敏度的制备

Fig. 4

图4所示。从二级文库中选择亲和成熟的Nb突变体，其中4个经分子对接分析确认的关键残基随机突变。(A) Nb A4与香豆磷、体积、表面积、深度的立体图及相互作用。常规氢键、碳氢键和烷基分别以深绿色、浅绿色和粉红色表示。(B)用ic-ELISA分析Nb A4和丙氨酸扫描突变体的活性。(C) 45个克隆的PE-ELISA鉴定。每个克隆的抑制率用点表示。阳性克隆被测序，颜色代表重复发现的克隆。蓝点表示具有未知序列的克隆。(D)阳性突变体序列。

Fig. 5

图5所示。Nb - 3G分别与香豆磷(A)、对硫磷(B)、三唑磷(C)和喹硫磷(D)的相互作用分析。常规氢键、范德华键、碳氢键、酰胺- π堆叠键、烷基键、π阴离子键分别显示为深绿色、绿色、浅绿色、深粉色、粉色和橙色。

4. 建立ic-ELISA测定香豆磷的方法

Fig. 6

图6.基于Nb 3G的ic-ELISA标准曲线

本文提出了一种基于设计合成的Nb库生成化学污染物纳米体的新策略，并首次成功地对半抗原物质香豆磷的Nb进行了选择。虽然从合成文库中获得的原始Nb亲和力相对较差，但通过分子进化，获得灵敏度增强的Nb突变体，是与合成文库中Nb选择匹配的良好途径。最后，建立了定量限远低于MRL值的联酶联免疫吸附测定法。同时，通过回收率试验验证了所建立的ic-ELISA的准确性和实用性。总的来说，所提出的合成Nb文库策略简化了Nb的制备过程，绕过了动物免疫步骤，并且本工作中合成的Nb文库为生成针对化学污染物的特定纳米体提供了另一种可能性。