题目：Ultrasensitive Lateral-Flow Assays Via Plasmonically Active Antibody-Conjugated Fluorescent Nanoparticles
期刊：
影响因子：28.1
原文链接： https://www.nature.com/articles/s41551-022-01001-1
汇报人：田佳琪 2023 级硕士
免疫层析法（LFAs）是快速和廉价的，但它们的灵敏度比基于实验室的检测低近1000倍。在这里，作者表明，等离子体活性抗体偶联的荧光金纳米棒使传统的LFAs变的超灵敏。通过标准台式荧光扫描仪读取的等离子体增强型LFA的检测时间在20分钟内，与长达4小时的金标准酶联免疫吸附测定相比，其动态范围和检测限提高了约30倍，对严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2（SARS-CoV-2）患者的血浆中的抗体及鼻咽拭子中的抗原的临床灵敏度达到95%，特异性为100%。通过廉价的便携式扫描仪也可以实现测定性能的类似改进，正如在检测人血清样本中的白介素-6和鼻咽样本中SARS-CoV-2的核衣壳蛋白时所显示的那样。等离子体增强型LFAs在灵敏度、速度、动态范围、易用性和成本方面都优于标准的实验室检测，并可能在即时诊断方面提供优势。
侧流分析（LFA）是最简单、最快和最便宜的即时诊断方法之一，在疾病的人群水平筛查方面具有极大的潜力。尽管现阶段已经出现了许多针对新冠病毒（SARS-CoV-2）抗体和抗原的侧向流试纸检测，但没有一种侧向流检测的敏感性和定量效果可以与基于实验室设备的诊断方法相比，例如如实时逆转录PCR（RT–PCR）和酶联免疫吸附试验（ELISA）。通常，常规比色侧向流检测的灵敏度比这些标准实验室测试低1000倍，使用LFA进行诊断需要额外的基于实验室的验证性测试，以确定其阴性结果。由于相对于目标分析物的浓度变化的颜色变化范围有限，比色LFA通常不足以进行很好的定量信号读出。
使用荧光信号来提高侧向流检测的生物分析性能，有很多方法，例如使用荧光分子或量子点作为信号报告分子。尽管荧光信号分子改进了定量效果，但其相对较弱的信号强度限制了其灵敏度和即时检测（POCT）的实用性，并且与常规胶体金纳米颗粒（AuNPs）相比，其对光吸收较低阻碍了常用的侧向流检测允许的视觉检测。此外，它们还需要使用具有高灵敏度检测器或强大激发光源的侧向流信号读取器。这些考虑因素限制了荧光侧向流检测在大规模筛选和资源有限的环境中的应用。
基于此，华盛顿大学，Srikanth Singamaneni教授团队提出了一种“双峰”侧向流检测方法，其中该分析方法可以通过视觉测试信号进行初始筛选，并可以使用荧光读取器在相同的LFA条上进行后续定量测试。作者通过测试血浆、血清和鼻咽拭子样本分别检测IL-6、SARS-CoV-2 S1抗体和SARS-CoV-2抗原，验证了基于等离子体荧光的LFAs（p-LFAs）的临床疗效，并获得了很高的临床特异性和敏感性。作者还使用与等离子体荧光兼容的便携式自行设计扫描仪验证了p-LFA的定量能力，以验证其多功能即时检测应用。
1. AuNP种子的放大消耗AuNPs和等离子体荧光粒子作为LFAs纳米标记物的对比
图1 a. 等离子荧光纳米粒子的示意图，用作 LFAs 中的“双峰”纳米标记材料 (比色+荧光)，包括以 AuNPs 作为等离子核，聚合物层作为间隔，分子荧光团 (800 CW) 和生物素作为识别元件。b.c. AuNPs (b) 和等离子荧光粒子 (c) 的透射电子显微镜图像。d. 不同浓度 AuNPs 滴涂在硝酸纤维素膜上获得的平均灰度值。插图：硝酸纤维素膜的 8 位 ImageJ 处理图像。e，f. 不同浓度的等离子体荧光粒子（e) 和分子荧光团 (f) 从硝酸纤维素膜上滴涂得到的荧光强度。insets：硝酸纤维素膜对应的荧光图像. g. 不同浓度链霉亲和素标记的AuNPs暴露后，以 biotin 结合的 BSA 作为检测点的捕获配体，从硝酸纤维素膜获得的平均灰度值. 插图：链霉亲和素标记的 AuNPs 的示意图。h. 在不同浓度的链霉亲和素标记的等离子体荧光照射后，以生物素化的 BSA 为识别元件，从硝酸纤维素膜上获得的荧光强度。插图：链霉亲和素偶联的等离子体荧光的示意图。紫色箭头指示纳米复合物的流动方向。
2. 使用p-LFA对人类细胞因子human IL-6定量分析的结果
图2 a. IL-6 LFA条的示意图，其包括IL-6捕获抗体测试点和绵羊IgG对照点。b. c. 基于AuNP的IL-6 LFA（b）和剂量依赖性平均灰度值（c）的示意图，对应于从这些基于AuNP LFA获得的不同IL-6浓度。d. e. IL-6 p-LFA（d）和IL-6 p-LFB（e）的剂量依赖性荧光强度的示意图。f. g. 基于AuNP的IL-6 LFA（f）和IL-6 p-LFA（g）的八位ImageJ处理图像，描绘了视觉读出模式。h. IL-6 p-LFA条带的荧光图像描绘了荧光读出模式。i. ELISA、p-FLISA和p-LFA的RMC曲线。虚线表示μ=2和μ=5时的RMC截止值；虚线和RMC曲线的交叉点指示浓度范围，在该浓度范围内实现了测定的特定定量性能。j. IL-6的p-LFA在7个月内的稳定性。
3. 使用p-LFA对SARS-CoV-2血清抗体定量分析的结果
图3 a. SARS-CoV-2 S1抗体LFA条带的示意图，其包含重组SARS-CoV-2 S1蛋白作为测试点处的捕获元件和对照点处的绵羊IgG。b. d. 基于AuNP的SARS-CoV-2 S1抗体LFA（b）和等离子荧光SARS-CoV-2 S1抗体LFA（d）的示意图。c. 从基于AuNP的LFA获得的与SARS-CoV-2 S1抗体的不同浓度相对应的剂量依赖性平均灰度值。e. 在20分钟内进行的SARS-CoV-2 S1抗体p-LFA的剂量依赖性SNR比率。f.g. 基于AuNP的SARS-CoV-2 S1抗原LFA（f）和SARS-CoV-2 S1抗体p-LFA（g）的八位ImageJ处理图像，描绘了视觉读出模式。h. SARS-CoV-2 S1抗体p-LFA条带的荧光图像，描绘了荧光读出模式。i. j. 剂量依赖性光密度和荧光强度，对应于不同的SARS-CoV-2 S1抗体浓度，通过在微量滴定板上实施的标准ELISA（i）和p-FLISA（j）获得，在4小时内进行。
4. 使用p-LFA对SARS-CoV-2及其变种的N蛋白定量分析的结果
图4 a. 包含N蛋白捕获抗体作为测试点和绵羊IgG作为对照点的N蛋白p-LFA条的示意图。b. c. 用于N蛋白检测的p-LFA的比色（b）和荧光（c）读出模式。d. 剂量依赖性平均灰度值，对应于不同浓度的N蛋白，从比色p-LFA（黑色）和20分钟内进行的N蛋白荧光定量p-LFA的剂量依赖性SNR（红色）中获得。e. 剂量依赖性光密度和荧光强度，对应于不同的N蛋白浓度，通过在微量滴定板上实施的标准ELISA（黑色）和p-FLISA（红色）获得，在4小时内进行。f. 荧光定量p-LFA（红色）和商业POC快速抗原试剂盒（BD Veritor）（黑色）的比较。g. PCR阳性NP拭子样本（野生型SARSCoV-2）中的N-蛋白SNR通过比色p-LFA（灰色）、荧光p-LFA和BD Veritor测定。h. 就定量35个PCR阳性样本（19个野生型SARS-CoV-2和16个Delta变体）的NP拭子样本中存在的N蛋白浓度的能力而言，比较比色（灰色）和荧光（黑色）p-LFA。ND，未检测到。i. NP拭子样本中的N蛋白SNR检测为新冠肺炎阴性，不同季节性冠状病毒和其他呼吸道病毒阳性。
5. 使用廉价便携式荧光扫描仪验证p-LFA
图5 a. 便携式荧光扫描仪照片。b. 研究中使用的LFA盒的示意图和p-LFA的工作流程。S,T和C分别对应于样本焊盘、测试线和控制线。蓝色箭头表示使用便携式扫描仪在LFA盒上进行荧光测量的方向。c. 使用便携式扫描仪获得的代表性正（黑色）和负（红色）信号。d. 荧光强度（黑色球体）和曲线下面积（红色球体）由LFA条带获得，用不同浓度的等离子荧光滴注，使用台式和便携式扫描仪进行扫描。e. 八位ImageJ处理的描绘视觉读出模式的全带IL-6比色p-LFA的图像。f. 描绘荧光读出模式的全带IL-6荧光计p-LFA的荧光图像。g. 通过台式（黑色）和便携式扫描仪（红色）测量的15分钟IL-6荧光p-LFA的剂量依赖性信号。h. 血清样品中IL-6浓度的线性回归图，通过荧光定量p-LFA测定，并使用台式和便携式扫描仪测量。i. 通过4小时实验室p-FLISA和台式荧光扫描仪测定血清样品中IL-6浓度的线性回归图，与使用15分钟荧光计p-LFA和便携式扫描仪进行的测量进行比较。j. NP拭子样品中N蛋白浓度的线性回归图，通过荧光定量p-LFA测定，并使用台式和便携式扫描仪测量。
