题目：M13 Bacteriophage-Assisted Recognition and Signal Spatiotemporal Separation Enabling Ultrasensitive Light Scattering Immunoassay
期刊：ACS NANO
影响因子：17.1
原文链接：https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/acsnano.3c07194
汇报人：王夏彤2022级硕士
纳米探针尺寸效应导致的分子识别和信号放大之间的矛盾使传统的基于免疫分析的检测方法的灵敏度受到限制，本研究采用了多功能的M13噬菌体辅助免疫识别和信号转导时空分离，使用超灵敏的光散射免疫测定系统能够定量检测低丰度目标分析物。鉴于M13噬菌体介导的杠杆效应和GISG放大的光散射信号调制的协同作用，该策略的实际检测能力可以在50 min内实现亚飞摩尔水平真实样品中赭曲霉毒素A和甲胎蛋白的超灵敏快速定量。为了进一步提高我们免疫测定的灵敏度，实施了生物素-链霉亲和素扩增方案检测严重急性呼吸系统综合症冠状病毒 2-刺突蛋白，灵敏度达到阿摩尔范围。综上所述，本研究通过M13噬菌体介导的杠杆效应和GISG放大光散射信号调制的协同组合，为目标分析物的超灵敏定量检测提供了方向。
免疫测定法因其灵敏、特异性和准确的定量检测，对低丰度目标分析物的测量中起着关键作用。通常，免疫测定方法采用特异性抗原-抗体识别来操纵分析物浓度依赖性信号转导，以定量检测样品中的靶分析物。随着信号转导的快速发展，免疫测定技术已从传统的比色测定逐渐演变为基于荧光，化学发光，等离子体，电化学，拉曼散射以及质谱的检测。鉴于这些显著的进步，免疫测定的分析灵敏度得到了显著提高，检测限与PCR相当。尽管取得了这些成就，但超灵敏目标检测的新方法和技术的创新仍然迫在眉睫，并且仍然极具挑战性。
高效的分子识别和高灵敏度的信号转导是实现高性能免疫分析的关键。与传统的单信号分子标记相比，载有大量信号分子的微纳载流子作为信号放大探针理论上可以提高灵敏度，因为大尺寸的微纳载流子比小尺寸载流子含有更多的信号分子。然而，由于信号探针从本体溶液扩散到目标捕获表面的速度较慢，以及纳米探针尺寸增加的空间位阻效应，导致传感元件/换能器界面处的免疫反应效率低下，因此大多数表面分析技术在反应动力学和灵敏度方面存在局限性。
本工作研制了一种通用的超灵敏识别和信号时空分离光散射免疫测定法，用于低丰度目标分析物的定量检测。具体而言，M13噬菌体通过噬菌体展示技术在pIII蛋白处的纳米抗体以选择性地识别目标分析物，并进一步用生物素分子进行化学修饰，以增加链霉亲和素（SA）修饰的小尺寸AuNPs扰动M13噬菌体的杠杆作用，使用涂有抗体或抗原的磁性纳米颗粒（MNP）通过特异性免疫识别来指导基因工程 M13 噬菌体的组装。
1. M13噬菌体介导的杠杆效应对AuNP种子的放大消耗
图1（a）基于链霉亲和素-生物素识别的小尺寸AuNPs与M13噬菌体结合的示意图。（b）激光扫描共聚焦显微镜成像验证生物素分子与M13噬菌体的成功结合。AuNPs、AuNP@SA、M13 + AuNP@SA和M13@biotin+ AuNP@SA的平均（c）流体动力学直径和（d）紫外-可见吸收光谱。（e） MNP@mAb + M13OTA@biotin + AuNP@SA的TEM图像。
2. 基于GISG策略的AuNPs光散射强度调控
图2（a）GISG扩大AuNP尺寸的策略原理示意图。AuNP@SA GISG处理前后的（b）TEM图像，（c）流体动力学直径分布，和（d）的紫外-可见吸收光谱。不同条件下AuNPs在512和561nm处的（e）光散射强度变化和（f）吸光度变化AuNP@SAGISG处理前后的浓度。
3. M13噬菌体驱动的竞争性小分子光散射免疫测定
图3（a）基于M13OTA@biotin的竞争光散射免疫测定示意图。（b）对一系列OTA标准溶液浓度的竞争抑制率，范围从0.01 fg mL–1到16 pg mL–1（c）建立的竞争性光散射免疫测定法OTA定量的定量校准曲线。(d) OTA（10 pg mL–1）检测该免疫测定法对其他常见干扰真菌毒素的特异性评估，包括浓度为10 ng mL–1的ZEN、AFB1、AFB2、DON和CIT。（e）所提出的光散射免疫测定法和高效液相色谱法检测OTA玉米样品的检测结果之间的相关性分析。（f）不同OTA浓度下（1，30，300，3000 fg mL–1）MNP@mAb-M13OTA@biotin-AuNP@SA的 TEM图像。
4. M13噬菌体驱动的生物大分子夹心光散射免疫测定
图4（a）基于M13OTA@biotin的夹心光散射免疫测定示意图。（b）一系列AFP标准溶液浓度（0 pg mL–1-20 ng mL–1）的光散射强度范围（c）夹心光散射免疫测定法测定AFP的定量校准曲线。（d）AFP（20 ng mL–1）该免疫测定对其他常见干扰疾病蛋白生物标志物的测定的特异性评估，包括浓度为20 ng mL-1的PCT、CEA、CRP、PSA和HBsAg。（e）所提出的光散射免疫测定和商业化学发光免疫测定试剂盒获得的检测结果在定量AFP血清样品中的相关性分析。
5. M13噬菌体驱动的光散射免疫分析在大流行管理中的性能验证
图5（a）基于M13Nb@biotin竞争性光散射免疫测定SARS-CoV-2 S 蛋白的工作原理示意图。（b） 用于测量SARS-CoV-2 S 蛋白的生物素-链亲和素扩增方案示意图。对一系列S蛋白标准溶液浓度（0 pg mL-1-10 pg mL-1）的竞争抑制率（c）不含和（e）使用生物素-链亲和素扩增方案。使用所开发的竞争性光散射免疫测定法的S蛋白定量校准曲线（d）不含和（f）含生物素-链霉亲和素扩增方案。（g）TEM图像显示每个MNP周围有更多的M13噬菌体。（h）高分辨率图像进一步证实了许多小型AuNP@SA附着在M13噬菌体的丝状表面上。
