近日，课题组周莹博士在ACS Applied Materials & Interfaces上发表了题为“Sensitive and Low-Bias Transcriptome Sequencing Using Agarose PCR”的研究论文，将低熔点琼脂糖用于PCR扩增反应及后续转录组建库应用中提高灵敏度及降低偏性的研究，获得了良好的效果。

[背景介绍]

近年来，单细胞转录组建库和测序技术已成为分子生物学研究的一个极其重要的分支。但是，从单个细胞中分离出的RNA数量不足以进行转录组文库的构建和测序，这就需要高效的扩增来产生足够数量的产物，同时尽量减少扩增后和扩增前存在的偏差。现有的扩增方法大致可分为等温扩增和变温扩增。无论哪种扩增方法，都有一个问题，即扩增产物能否忠实地代表原始模板，这被定义为扩增偏差。目前还无法区分不同细胞之间的生物学差异是否与从痕量RNA开始的cDNA扩增方案中固有的扩增偏差有关。改进扩增方法的目的是能够实现无偏差和均匀的扩增，以确保以最小的测序工作量获得最大的覆盖率。因此，开发一种简单而有效的方法来减少核酸扩增的偏差，对生物学领域具有重要意义。

 [文章亮点]

近日，课题组的周莹博士在ACS Applied Materials & Interfaces上发表了使用低熔点琼脂糖PCR于扩增反应及后续转录组建库应用中提高灵敏度及降低偏性的研究。琼脂糖作为常用的电泳材料其凝胶独特的微孔结构具有分离扩增反应介质的作用。在PCR反应过程中会呈现出液态及凝固态交界的状态，可以通过其分子拥挤作用及利用其聚合物交联结构有效提高扩增反应的灵敏度及降低偏性。

图1. 低熔点琼脂糖在PCR反应过程中的状态改变

另外，在单细胞水平的转录组建库结果显示，琼脂糖PCR的使用能够有效提高灵敏度，并与扩增之前的大样本数据更为接近，即能够有效降低扩增反应带来的偏性。

图2. 基于琼脂糖PCR的SMART建库结果与普通PCR建库结果的比较

 [总结/展望]

研究团队将低熔点琼脂糖应用于单细胞转录组建库的预扩增步骤之中，充分发挥其聚合物交联结构的限制作用和自身的分子拥挤效应，使其在转录组文库测序中发挥了关键作用。随着低熔点琼脂糖的加入，扩增反应的灵敏度明显提高，在帕金森疾病的相关基因检测的空间转录组研究结果也显示了11%的灵敏度的提升。该研究为痕量样本的高效及均匀扩增提供了一种新的工具，可广泛应用于单细胞转录组的研究之中。

出版信息：

ACS Applied Materials & Interfaces. 2022, 14, 17, 19154–19167

原文链接：https://doi.org/10.1021/acsami.2c02133；https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsami.2c02133