1. 引言：

肝星状细胞（HSCs）是肝脏特有的一种非实质细胞，在维持肝脏内部稳态中发挥至关重要的作用。研究表明，在肝癌发生发展过程中，异常活化的肝星状细胞（aHSCs）能够促进肝癌免疫逃逸，削弱肝癌免疫治疗疗效。然而，aHSCs如何调控肝癌免疫逃逸的详细分子机制仍不清楚。考虑到HSCs的活化过程伴随着脂质代谢和ROS的大量产生，能够引起肝癌微环境的氧化应激，进而深刻影响肝癌免疫逃逸，超氧阴离子（O₂^•−）作为最先生成的ROS，在脂质代谢过程中大量产生，且在氧化应激造成多种疾病过程中起关键作用。然而，由于缺乏合适的研究手段，当前并未有研究工作揭示aHSCs中的O₂^•−水平变化，以及如何调控肝癌免疫逃逸的详细分子机制。因此，迫切需要开发一种荧光探针，探究活体深层组织内HSCs中的O₂^•−的实时、原位、动态水平变化，能够为揭示aHSCs调控肝癌免疫逃逸的详细分子机制提供有效信息。

2. 成果简介：

基于以上背景，山东师范大学唐波教授/李平教授课题组发展了一种双光子荧光探针（TPH）用于HSCs活化过程中O₂^•−的实时、动态可视化，并揭示了HSCs中O₂^•−在诱导肝癌免疫逃逸中的作用。该成果以“Fluorescence imaging sheds light on the immune evasion mechanisms of hepatic stellate cells mediated by superoxide anion”为题发表在国际权威杂志Communications Biology上。山东师范大学博士研究生毛元涛和武传琛为本文的共同第一作者，山东师范大学王昕副教授、山东中医药大学李霞教授、山东师范大学李平教授和唐波教授为论文共同通讯作者。

本文中，作者报道了一种具有HSCs靶向、可逆的双光子荧光探针（TPH），TPH能够高灵敏、高选择性以及可逆响应O₂^•−。TPH的原位成像首次揭示了HSCs活化过程O₂^•−的过量产生。作者揭示了HSCs活化细胞内O₂^•−—细胞周期蛋白依赖性激酶4（CDK4）—fizzy和细胞分裂周期20相关1（FZR1）—斑点型BTB/POZ蛋白（SPOP）—程序性细胞死亡配体1（PD-L1）级联信号通路，首次阐明了HSCs活化过程中O₂^•−在肝癌免疫逃逸过程中的重要性。这项工作证实了TPH在揭示HSCs诱导肝癌免疫逃逸相关分子机制的巨大潜能。

3. 图文解说：

图1  TPH的结构和响应机制。为了构建具有HSCs靶向性的O₂^•−可逆响应荧光探针，咖啡酸作为O₂^•−特异性的识别基团和相应的荧光团，多肽序列作为HSCs的靶向基团。作为常用的O₂^•−清除剂，咖啡酸被用作O₂^•−高特异性的识别基团，O₂^•−特异性氧化咖啡酸中的邻苯二酚基团生成苯醌，从而促进蓝色荧光的产生。咖啡酸基团与O₂^•−的反应过程具有可逆性，有望动态追踪O₂^•−水平变化。

图2  TPH的荧光性质。与20 μM O₂^•−反应前后TPH的吸收光谱（a）和荧光光谱（b）。（c）TPH在490 nm处的荧光强度与O₂^•−水平的关系。（d）加入不同浓度的O₂^•−（0-20 μM）后，TPH的荧光光谱变化。

图3  LX-2细胞的O₂^•−荧光成像。（a）LX-2细胞内源性O₂^•−荧光成像。a1：对照组；a2：2-Me（0.1µg mL⁻¹，O₂^•−刺激剂）孵育15分钟；a3：2-Me孵育后，加入Tiron（10 µM，O₂^•−清除剂）孵育30分钟。（c）LX-2细胞活化过程的O₂^•−荧光成像。c1：对照组；c2：TGF-β1（5 ng mL⁻¹）孵育12 h；c3：TGF-β1孵育后，加入Tiron（10 µM）孵育30分钟。（b）和（d）分别为a和c图的平均荧光强度输出。

图4  不同活化程度LX-2细胞的O₂^•−荧光成像。（a-e）不同TGF-β1浓度或时间孵育LX-2细胞的荧光成像。（f）a-e的平均荧光强度输出。

图5  不同活化水平HSCs的小鼠的双光子荧光成像。（a-c）为了构建具有不同活化水平HSCs的小鼠模型，分别腹腔注射橄榄油或CCl₄溶液2、4和6周。对照组：橄榄油；CCl₄组：20%的CCl₄溶液。（d）抑制HSCs活化小鼠的荧光成像。首先向小鼠腹腔注射CCl₄溶液6周，随后腹腔注射生理盐水溶液或D-青霉胺（D-pen，HSCs活化抑制剂）2周。

图6  不同活化程度HSCs的小鼠肝癌模型的O₂^•−成像和免疫荧光染色。（a-b）普通HCC小鼠和aHSCs HCC小鼠的O₂^•−成像和免疫荧光染色（CD8⁺ T细胞）。（c-d）aHSCs HCC小鼠和HSCs活化被抑制的HCC小鼠的O₂^•−成像和免疫荧光染色（CD8⁺ T细胞）。

图7  不同活化程度HSCs的小鼠肝癌模型的免疫印迹实验。（a）普通HCC小鼠和aHSCs HCC小鼠的免疫印迹实验。（b）aHSCs HCC小鼠和HSCs活化被抑制的HCC小鼠的免疫印迹实验。

图7  CDK4蛋白的质谱分析。（a）组氨酸（His） 30；（b）His 68；（c）His 95。

4. 总结与展望：

为了探索HSCs中O₂^•−在HCC免疫逃避中的作用，我们开发了一种双光子荧光探针TPH，用于特异性成像检测O₂^•−。利用TPH，我们观察到HSCs在活化过程中O₂^•−的爆发。值得注意的是，我们发现在不同活化水平HSCs的HCC小鼠模型中，HCC微环境的免疫抑制能力与HSCs的激活状态相关。进一步的研究表明，HSCs活化生成的过量O₂^•−损伤了CDK4的功能区域，导致CDK4失活。随后，FZR1磷酸化降低，导致更多的SPOP降解。SPOP的降低导致HCC小鼠中PD-L1的增加，最终诱导免疫逃逸。这项工作提供了HSCs中O₂^•−介导肝癌免疫逃逸的分子机制。我们认为这项工作可以为了解HCC的发生和发展提供补充。同时，也有望为肝癌的免疫治疗方法提供新的思路。

5. 全文链接：

全文链接：https://doi.org/10.1038/s42003-024-06245-y

6. TOC：