1. 引言

      肝癌免疫逃逸的详细分子机制不清楚，严重阻碍了免疫治疗的开发及应用。肿瘤微环境（TME）内细胞间相互作用是免疫逃逸发生的必需途径。其中，肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）与肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）的协同变化是造成肝癌免疫逃逸的重要因素。尽管有工作报道了CAFs和TAMs对肿瘤进展的重要性，二者之间的细胞间相互作用机制仍未被完全揭示。尤其是在肝癌进展过程中，CAFs和TAMs的协同作用极少被探究，详细的分子机制仍未被完全揭示。

       精氨酸酶（ARG）是TAMs中表达较高的活性分子，具有消耗精氨酸使T细胞耗竭等功能，在TAMs介导的免疫逃逸过程中发挥重要作用。此外，ARG参与调控下游的脯氨酸生成通路，进一步影响ECM的生成。这些发现提示TAMs可能通过ARG调节产生ECM的CAFs的活性，进而影响肝癌免疫逃逸，然而，ARG参与TAMs和CAFs的相互作用过程的详细分子机制的仍然未知。细胞间的通讯是一个连续、多变的动态过程，受到细胞分泌的多种活性分子的协同调控。然而，目前常用的比如Western blot，PCR法等体外表征方法，难以探究真实生理环境中的ARG在TAMs和CAFs相互作用过程中的连续、动态变化。基于高时空分辨率的荧光成像分析方法是揭示ARG在TAMs和CAFs相互作用过程中的连续、动态变化的有力工具。然而，目前仍然缺乏成像检测ARG的成像方法和材料。

      2. 成果简介

       基于以上背景，山东师范大学唐波教授/李平教授课题组建立了TAMs中ARG的成像新方法，探究了ARG介导的AMs和CAFs间相互作用的分子机制。该成果以“Tracking interactions between TAMs and CAFs mediated by arginase-induced proline production during immune evasion of HCC”为题发表在国际权威杂志Aggregate上。

       该方法利用靶向ARG后发出明亮荧光的小分子荧光探针TPEARG，实现了细胞及活体中ARG动态变化的成像检测。联合检测CAFs活化程度的成像策略，考察了TAMs中ARG的实时、动态变化作用于CAFs活化并促进肝癌免疫逃逸的过程。实验结果表明，随着TAMs中ARG的水平升高，脯氨酸的含量显著上升。在此前的工作中发现，CAF促进免疫逃逸的机制涉及JAK-STAT信号通路的下调。这条信号通路深度参与多种癌细胞免疫逃逸。因此，本工作进一步探讨了该信号通路的表达。结果显示，脯氨酸含量升高能显著提高CAFs的活化程度，造成肝癌免疫逃逸标志物上调。结合对相关信号通路的分析，揭示了TAMs和CAFs协同作用于肝癌免疫逃逸的新机制。

3. 图文解说

图1 TPEARG的结构和荧光性质。（A）TPEARG的结构和识别ARG机制。TPEARG的荧光强度随着溶液极性（B）和黏度（C）的增加而增强。（D）当与ARG相互作用时，TPEARG发出荧光，强度随精氨酸酶浓度的增加而增加。（E） TPEARG的荧光强度与ARG浓度之间的线性关系。（F， G）TPEARG对多种干扰因素的选择性。TPEARG 1μM, λex= 390 nm。

图2  TPEARG和ARG的结合模拟（PDB：2CEV）。 （A）：TPEARG在ARG蛋白（PDB: 2CEV）亲疏水性表面的结合，蓝色和橙色分别表示蛋白表面的亲水和疏水部分。(B)：TPEARG与ARG蛋白的二维结合模式，绿色虚线表示氢键作用，紫色实线表示配位相互作用，红色齿轮状表示疏水作用。（C）TPEARG在ARG蛋白三维结构中的位置。（D）TPEARG与ARG蛋白的三维结合模式图，绿色虚线表示氢键作用。

图3 TPEARG用于ARG的动态变化成像检测。（A）使用1 μM TPEARG分别成像用BEC预处理不同时间的M2巨噬细胞。（B） 图A的荧光强度输出。数据以均值±标准差表示。n=3。

图4 探究ARG与脯氨酸的关系。（A）ARG通过脯氨酸调控免疫逃逸的推测原理图。（B）M1型巨噬细胞、M2型巨噬细胞中脯氨酸含量。（C）检测ARG变化导致脯氨酸含量的变化。数据以均值±标准差表示。n=3。

图5 探究ARG在TAMs和CAFs互作过程中的作用。将HSCs细胞系LX-2细胞使用DMEM（对照组）、M2巨噬细胞培养基、添加10 μg/mL的脯氨酸的DMEM中、添加10 μg/mL的天冬酰胺的DMEM中和添加10 μg/mL的半胱氨酸的DMEM培养12 h。随后使用10 μM/mL Cy-FAP对各组中的CAFs标志物FAP进行成像检测。数据以平均±标准偏差表示。n = 3。比例尺= 25 µm。

图6 使用TPEARG和Cy-FAP成像探究TAMs和CAFs的互作过程。1 µM TPEARG和10 µM Cy-FAP分别成像正常小鼠、小鼠原位肝癌模型、ARG被刺激的肝癌小鼠（LPS）和ARG被抑制的肝癌小鼠（BEC）中的ARG表达量和CAFs活化程度。

图7 对高表达ARG的小鼠进行基因和信号通路分析。（A）对比高表达ARG和低表达ARG的小鼠肿瘤组织，使用基因表达数据进行基因集富集分析（GSEA），显示基因上调和下调热图。（B）GSEA结果显示‘ECM受体相互作用’信号通路在高表达ARG的小鼠中上调。（C）IL-2-JAK-STAT信号通路在高表达ARG小鼠肿瘤组织中下调。

4. 全文链接：

全文链接：https://doi.org/10.1002/agt2.530

原文引用：DOI:10.1002/agt2.530

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编辑：武传琛

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