1. 引言

负责合成，运输，分泌神经递质5-羟色胺(5-HT)的5-羟色胺能神经元在脑部生理活动中发挥了关键作用。脑部氧化应激导致的5-羟色胺能神经元功能紊乱与多种精神疾病的发生发展密切相关。作为氧化应激的重要标志物之一超氧阴离子自由基（O₂^•−）可以对蛋白、核酸、脂质等造成氧化损伤，影响神经元功能。因此，探究5-羟色胺能神经元内O₂^•−的水平变化以及介导的信号通路是揭示抑郁症发病机制的关键。但是目前能够特异性靶向5-羟色胺能神经元原位、实时监测O₂^•−水平变化的工具还未见报道。

2. 成果简介

基于以上背景，山东师范大学唐波教授/李平教授课题组发展了以5-HT和帕罗西汀为靶向基团，以咖啡酸作为荧光团和O₂^•−的识别基团构建两个新型荧光探针PA-CA和HT-CA，用于成像5-羟色胺能神经元中O₂^•−水平的变化。利用PA-CA和HT-CA，我们实现了在特异性表达SERT的细胞中成像O₂^•−。通过双光子荧光成像技术，我们实现了对抑郁小鼠活体大脑中5-羟色胺能神经元中的O₂^•−的原位观察。此外，通过蛋白质组学分析了O₂^•−对SERT的氧化修饰。这项工作证明了PA-CA和HT-CA在探究5-羟色胺能神经元相关疾病方面具有潜力。

该成果以“Tracing Superoxide Anion in Serotonergic Neurons of Living Mouse Brains with Depression by Small-Molecule Fluorescence Probes”为题发表在杂志Analytical Chemistry上。文章第一作者是山东师范大学王昕博士和博士研究生车飞达，山东师范大学李平教授和唐波教授为论文共同通讯作者。

3. 图文解说

图1  （A）HT-CA和PA-CA的分子结构。（B）50 μM PA-CA和50 μM HT-CA在与50 μM O₂^•–反应之前（黑色）和之后（红色）的吸收光谱。（C） 50 μM PA-CA和50 μM HT-CA与50μM O₂^•–反应前（黑色）和反应后（红色）的荧光发射光谱。（D） 50μM PA-CA与O₂^•–（0-50μM）反应后的荧光光谱（左），以及荧光强度与O₂^•–浓度之间的关系（右）。（E） 50 μM HT-CA与O₂^•–（0-50μM）反应后的荧光光谱（左）以及荧光强度与O₂^•–浓度之间的关系（右）。（F） 50 μM PA-CA和（G）50 μM HT-CA与其他常见干扰物质的荧光响应（100 μM Ca²⁺, (2) 10 mM K⁺, (3) 100 μM Mg²⁺, (4) 10 mM Na⁺, (5) 100 μM Fe³⁺, (6) 100 μM Fe²⁺, (7) 100 μM Cu²⁺, (8) 100 μM Mn²⁺, (9) 100 μM Ni²⁺, (10) 100 μM Zn²⁺, (11) 100 μM ClO^–, (12) 10 mM H₂O₂, (13) 100 μM NO, (14) 100 μM ¹O₂, (15) 100 μM ·OH, (16) 100 μM TBPH, (17) 1 μM ONOO^–, (18) 仅 50 μM 探针, (19) 50 μM O₂^•–）。

图2  （A） 用PA-CA对HEK293和hsert-HEK293细胞进行荧光成像。（B） A部分中相对荧光强度。（C）HT-CA对HEK293和hsert-HEK293细胞的荧光成像。（D） C部分中的相对荧光强度。

图3  （A） 50 μM HT-CA与SERT抗体对HEK293和hsert-HEK293细胞进行荧光成像。（B） A部分中相对荧光强度。（C）50 μM PA-CA与SERT抗体对HEK293和hsert-HEK293细胞进行荧光成像。（D） C部分中相对荧光强度。

图4  （A） 使用PA-CA对不同深度的大脑成像和3D图像。（B） A部分的相对荧光强度。（C）使用HT-CA对不同深度的大脑成像和3D图像。（D） C部分的相对荧光强度。Control组：未给药的小鼠。Stress组：连续给予皮质甾酮 21天的小鼠。

图5  （A） 转录组学分析的操作图。（B） 抑郁小鼠和正常小鼠5-羟色胺能神经元关键因子和SERT相关因子表达水平的比较。（C） LC-MS/MS蛋白质组学分析操作图。（D） C29的氧化。（E） H43的氧化。（F） H55的氧化。

4. 总结与展望

氧化应激可导致大脑生理功能受损，其中O₂^•–作为第一个产生的ROS，可以反映神经元的氧化应激水平。5-羟色胺能神经元具有合成和运输5-HT的功能，在大脑生理活动中起着关键作用。因此，探索O₂^•–在5-羟色胺能神经元中的功能对于理解脑部疾病是必要的。基于此，我们构建了两种新的荧光探针（PA-CA和HT-CA），用于SERT靶向和O₂^•–识别。PA-CA和HT-CA对O₂^•–检测均具有良好的灵敏度和优异的选择性。这两种探针都可以监测在氧化应激下特异性表达SERT的活hsert-HEK293细胞中O₂^•–的增强。通过双光子荧光成像，我们首次发现抑郁小鼠活体大脑中5-羟色胺能神经元中的O₂^•–显著增加。更重要的是，蛋白质组学分析表明，O₂^•–可以氧化修饰SERT活性位点的半胱氨酸和组氨酸。这项工作为活体脑成像提供了新的材料，并为理解抑郁症的分子机制提供了新的策略。

5. 全文链接

全文链接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.3c02701

6. TOC

编辑：车飞达

审核：李玺威