引言

肝脏缺血再灌注损伤（HIRI）是肝脏切除手术和肝脏移植手术中不可避免的并发症，是术后肝功能障碍和肝功能衰竭的主要原因。在HIRI发展进程中，加剧的氧化应激与受损的能量代谢协同作用，共同在肝损伤中发挥重要作用。超氧阴离子（O₂^•−）和三磷酸腺苷（ATP）分别为氧化应激和能量代谢相关的关键生物标志物。然而，由于缺乏合适的原位成像工具，O₂^•−和ATP在HIRI中的时空波动以及它们如何协同参与HIRI的病理机制目前尚不清楚。现有的O₂^•−或ATP响应型荧光探针由于其不可逆机制，不适合动态监测HIRI过程中O₂^•−和ATP的水平变化。因此，迫切需要开发一种荧光探针，能够在HIRI过程中同时、可逆地检测O₂^•−和ATP，这不仅能够监控HIRI过程中O₂^•−和ATP的时空、动态变化，而且有望揭示O₂^•−和ATP在HIRI中的相关性及调控机制。

成果简介

基于以上背景，山东师范大学唐波教授/李平教授课题组发展了一种双色双可逆分子荧光探针(UDP)用于HIRI过程中O₂^•−和ATP的实时、动态和同步可视化，并揭示了它们在HIRI中的相互关系和协同作用。该成果以“Unveiling the Crucial Roles of O₂^•− and ATP in Hepatic Ischemia−Reperfusion Injury Using Dual-Color/Reversible Fluorescence Imaging”为题发表在国际权威杂志Journal of the American Chemical Society上。该项研究工作也是唐波教授/李平教授课题组于2022年在Journal of the American Chemical Society（J. Am. Chem. Soc., 2022, 144, 1, 174–183; J. Am. Chem. Soc., 2022, 144, 30, 13586–13599）上发表关于药物诱导的肝损伤ONOO⁻和ATP的单/双光子成像与NIR-Ⅱ荧光引导HIRI的精准导航工作之后，在肝损伤研究方面取得的又一个突破性研究结果。文章第一作者是山东师范大学博士研究生刘继红，山东师范大学张雯副教授、巴斯大学吴庐陵博士、Tony D. James教授、山东师范大学李平教授和唐波教授为论文共同通讯作者。

本文中，作者报道了一种兼具双色和双可逆性质的荧光探针（UDP），UDP对O₂^•−和ATP的响应具有优异的灵敏度、选择性和可逆性，这使得UDP能够在蓝色和红色荧光通道中独立响应O₂^•−和ATP水平变化，没有光谱串扰。UDP在HIRI过程中的原位成像首次揭示了肝细胞和小鼠肝脏的同步O₂^•−爆发和ATP消耗。作者揭示了HIRI过程中细胞内的O₂^•−—琥珀酸脱氢酶（SDH）—线粒体内的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）—线粒体内的ATP—细胞内的ATP级联信号通路，首次阐明了O₂^•−和ATP在HIRI过程中的关联性。这项工作证实了UDP在动态监测HIRI和揭示HIRI发病机理的巨大潜能。

 图文解说

图1  UDP的结构和荧光性质。（A）UDP响应O₂^•−和ATP的可逆发光机制。为了构建O₂^•−和ATP双可逆响应的荧光探针，咖啡酸与罗丹明B分别作为O₂^•−和ATP特异性的识别基团和相应的荧光团，二者通过二乙烯三胺连接。作为常用的O₂^•−清除剂，咖啡酸被用作O₂^•−高特异性的识别基团，O₂^•−特异性氧化咖啡酸中的对苯二酚基团生成苯醌，从而促进蓝色荧光的产生。修饰二乙烯三胺的罗丹明螺内酰胺衍生物由于具有多个氨基，已被证明是ATP高灵敏和选择性的响应位点。咖啡酸基团与O₂^•−的反应过程和罗丹明螺内酰胺部分与ATP的结合作用均具有可逆性，有望动态追踪O₂^•−和ATP水平变化。（B）UDP响应不同浓度O₂^•−的荧光光谱。（C）UDP在470 nm处的荧光强度与O₂^•−水平的关系。（D）UDP的O₂^•−通道对常见干扰物质的选择性。（E）UDP响应不同浓度ATP的荧光光谱。（F）UDP在588 nm处的荧光强度与ATP水平的关系。（G）UDP的ATP通道对常见干扰物质的选择性。

图2  UDP的可逆性、光谱串扰和生物毒性评价。（A）添加O₂^•−(65 μM)和GSH(200 μM)后，UDP蓝色荧光的可逆响应循环。（B）在22 mM ATP存在下，加入不同浓度的O₂^•−(0-65 μM)后，UDP在O₂^•−通道的荧光光谱。（C）与65 μM O₂^•−和22 mM ATP反应前后UDP的吸收光谱。（D）添加ATP(22 mM)和三磷酸腺苷双磷酸酶(1 U/N)后，UDP红色荧光的可逆响应循环。（E）在65 μM O₂^•−存在下，加入不同浓度的ATP(0-22 mM)后，UDP在ATP通道的荧光光谱。（F）UDP的生物毒性评估。

图3  2-甲基雌二醇（2-ME）或寡霉素A（Omy A）刺激肝细胞中O₂^•−和ATP波动的共聚焦荧光成像。（A）2-ME（O₂^•−刺激剂）和钛铁试剂（O₂^•−清除剂）处理的肝细胞O₂^•−（蓝色通道，λ_ex = 405 nm, λ_em = 420-490 nm）和ATP（红色通道，λ_ex = 514 nm, λ_em = 525-668 nm）的共聚焦荧光成像。（B）Omy A（ATP抑制剂）和ATP处理的肝细胞O₂^•−和ATP的共聚焦荧光成像。(C, D)分别为(A, B)的相对蓝色和红色荧光强度输出。

图4  HIRI全过程中肝细胞O₂^•−和ATP波动的动态可视化及HIRI药物NAC的干预效果。（A）缺血0分钟、20分钟、40分钟，缺血40分钟后再灌注20分钟、缺血40分钟后再灌注40分钟以及0.5 mM、1 mM NAC预处理组肝细胞对O₂^•−(蓝色通道，λ_ex = 405 nm， λ_em = 420-490 nm)和ATP(红色通道，λ_ex = 514 nm， λ_em = 525-668 nm)进行荧光成像。(B, C) A图的相对蓝色和红色荧光强度输出。(D) ROS含量测定试剂盒测定HIRI不同时期的相对ROS水平。(E) ATP含量测定试剂盒测定HIRI不同时期的ATP水平。

图5  HIRI期间小鼠肝脏中O₂^•−和ATP动态的实时可视化。(A)操作示意图。(B)缺血0分钟、缺血20分钟、缺血40分钟及缺血40分钟再灌注20分钟、缺血40分钟再灌注40分钟小鼠肝脏中O₂^•−(蓝色通道，λ_ex = 405 nm， λ_em = 420-490 nm)和ATP(红色通道，λ_ex = 514 nm， λ_em = 525-668 nm)的荧光成像。(C, D) B图的相对蓝色和红色荧光强度输出。

图6  通过LC-MS/MS分析琥珀酸脱氢酶与O₂^•−反应的蛋白质组学。(A) C68, M71的氧化。(B) W47的氧化。(C) H57的氧化。(D) W218的氧化。*和红色表示的残基代表O₂^•−的修饰位点。

图7  HIRI过程中细胞内的O₂^•−—SDH—线粒体内的NADH—线粒体内的ATP—细胞内的ATP级联信号通路。（A）经不同处理的肝细胞的SDH活性分析。（B-C）经不同处理的肝细胞线粒体NADH含量。（D）经不同处理的肝细胞线粒体ATP含量。（E）在3-NPA作用下，使用UDP荧光成像肝细胞ATP。(F) E图的相对红色荧光强度输出。（G）经不同处理的肝细胞细胞ATP含量。（H）HIRI过程中细胞内的O₂^•−—SDH—线粒体内的NADH—线粒体内的ATP—细胞内的ATP级联信号通路。

总结与展望

本文成功开发了一个对O₂^•−和ATP具有高灵敏度和卓越选择性响应的双色双可逆的分子平台（UDP）。UDP能够同时、可逆响应O₂^•−和ATP，并且独立监控蓝色和红色通道内的荧光，而不受光谱串扰的影响。得益于探针在体外响应O₂^•−和ATP出色的性能，UDP成功被用于同时成像与动态监测肝细胞内源性的O₂^•−和ATP水平。通过分离良好的蓝、红光，UDP进一步被用来实时、原位可视化HIRI全过程中肝细胞内O₂^•−和ATP及HIRI药物的干预效果。更重要的是，UDP成功实现了HIRI过程中小鼠肝脏内O₂^•−和ATP的可视化。最后，本文首次揭示了HIRI过程中细胞内的O₂^•−—SDH—线粒体内的NADH—线粒体内的ATP—细胞内的ATP级联介导的信号通路。这项工作报道了首个研究HIRI中O₂^•−和ATP之间相关性和协同作用的荧光探针，有望为深入了解HIRI进展中相互联系的活性分子之间的相互作用提供多种机会。

全文链接：https://doi.org/10.1021/jacs.3c04303

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