1. 研究方向：D-蛋白质谱分析
【大背景：我国科学家主导的大科学计划“蛋白质组学驱动的精准医学（Proteomics-driven Precision Medicine, PDPM）”在肝癌、胃癌和肺腺癌等多种肿瘤的蛋白分子图谱绘制与强相关蛋白分子特征发现方面取得了一系列重大研究突破。然而，由于缺乏靶向神经退行性疾病全周期的长程蛋白质标志物，人类神经退行性疾病的早期精准诊断与干预，目前仍面临巨大挑战。】
【概论：针对“人类疾病关联蛋白变体的规模化发现及其构效精准解析”这一关键科学问题，李功玉课题组提出“D-蛋白组学驱动的精准医学（Stereoproteome-driven Precision Medicine, STEP-PPM）”新思路，依托非变性离子淌度质谱平台，开发基于跨尺度手性差异放大的构象分辨质谱技术，打破传统质谱无法鉴定分子量不变型翻译后修饰的技术壁垒，搭建《高性能构象分辨质谱》多场景分析系统【图1】，实现蛋白立体异构变体等新型翻译后修饰疾病标志物的规模化发现与构效解析【图2】。成功应用于神经退行性疾病和肿瘤标志物蛋白立体异构的构效关系研究，发现了疾病关联的新型蛋白变体，对于疾病关联的特殊蛋白结构亚型及其动态变化过程的分子机制理解具有重要的科研意义，并在人类疾病的病理机制解析、早期分子分型、个性化预后诊疗及精准靶标发现等方面具备可观的应用前景。】
2. 学术成绩
李功玉课题组的学术成果如下：
1） 搭建《高性能构象分辨质谱》多场景分析系统
蛋白立体异构，指的是蛋白骨架上的氨基酸中心碳原子，发生手性翻转，由传统的L型变成D型和其它异构形式的一种翻译后修饰。越来越多研究表明，多种生物体系中的神经肽和人类疾病（包括肿瘤和神经疾病）相关的生物标志蛋白常发生手性修饰。尽管其形成机制仍缺乏统一的认识，但与经典翻译后修饰相比，手性修饰并不改变蛋白分子量，引起的整体结构变化也较小，因此传统质谱技术无法规模化鉴定蛋白手性修饰。针对此，李功玉课题组依托非变性离子淌度质谱平台，独创性搭建《高性能构象分辨质谱》多场景分析系统【图1】，可实现蛋白手性修饰的“位点-结构-功能”三维关系的跨尺度质谱解析。
图1：李功玉课题组搭建的《高性能构象分辨质谱》多场景分析系统。
针对短肽异构修饰变体的手性差异识别，李功玉课题组利用多维度手性差异放大的核心思路，先后开发出非共价化学放大（Nat. Commun. 2019, 10, 5038）、共价化学放大（Anal. Chem. 2022, 3774; Nat. Commun. 2019, 10, 4697）、基于连续小波变换算法的数理放大（Anal. Chem. 2023, 2221）等多种不同策略，克服了传统离子淌度质谱在结构分辨率上的不足，实现不改仪器硬件的前提下提高超过十倍的结构分辨率，成功分辨淀粉样蛋白上5%的氨基酸发生D型手性突变引起的微小构象变化（CCS变化小于0.5%）。
【评价及学术影响：申请人因此受邀在多场国际学术报告会做邀请报告，并于分析化学顶级综述期刊Trends in Analytical Chemistry上撰写了离子淌度质谱在手性异构蛋白结构鉴定相关的综述文章（Trends Anal. Chem. 2020, 124, 115546）。其中共价化学放大的工作（Nat. Commun. 2019, 10, 4697）在报道之后，被选为亮点文章（Editors’ Highlights）在Nature Communications杂志首页置顶宣传，后期被F1000Prime网站推荐为领域内“特别重要”论文（Special Significance）；综述文献（Molecules 2020, 25, 4979）评价本工作为：“Promising for future applications in structural proteomics and imaging...”。】
针对完整蛋白异构修饰变体的手性差异识别，李功玉课题组发展出基于非靶向构象操控的数理放大策略，包含全离子构象去折叠技术（all ion unfolding, AIU）和全构象表征策略（CCS accumulation, CCSacc），有效提高了分析速度和通量的同时，还保留了所有电荷态的蛋白构象信息（Anal. Chem. 2023, 10895）。在此基础上，搭建了具备捕获完整蛋白瞬时构象动态变化功能的数字温控电喷雾和低温等离子体微液滴融合装置（Anal. Chem. 2024, 2292），结合自主开发的非靶向构象解析策略，有望用于拆分完整蛋白异构修饰变体的细微结构差异。
图2：神经疾病、肿瘤癌症与免疫治疗中的蛋白手性修饰结构与功能研究。
2） 解析神经退行性疾病相关蛋白D型手性修饰的构效调控作用
长期以来，D型氨基酸都被认为对淀粉样蛋白Aβ结构和功能有调控作用。然而，这背后的分子机制并不清晰，主要原因是缺乏合适的手性分析与鉴定手段。传统的免疫抗体捕获的方法往往具有手性偏好性，即选择性富集识别L型氨基酸残基，从而导致低丰度的D型手性突变体无法被有效捕捉到。李功玉课题组先后发展的系列手性差异放大策略和构象分辨质谱系统，首次揭示了不同氨基酸D型手性突变对淀粉样蛋白Aβ截断肽和全长蛋白Aβ42的单体结构、寡聚倾向以及对受体结合的差异性影响（Li* et al. Chem. Sci. 2023, 5936；Li et al. Nat. Commun. 2019, 10, 5038）。采用结构质谱指引下的副本交换分子动力学模拟，构建不同Aβ42立体异构体的三维空间结构模型，并发现N末端和核心区域的 Asp 和 Ser 残基的D型手性修饰显著压缩蛋白的整体空间构象。这种手性修饰诱导的结构调控作用可能与其减弱Aβ42-抗体的结合力以及降低Aβ42细胞毒性等方面的功能密切相关（Li* et al. Chem. Sci. 2023, 5936）。下一步的研究目标包括不同程度D型手性修饰的标志物蛋白立体异构体之间的交叉互作机制解析、通过isomerase异构化酶和Pimt异构修复酶实现蛋白D型手性修饰的定向精准调控以及规模化发现更多神经退行性疾病的蛋白D型手性修饰变体，为开发精准长程标志物和药物靶标提供新思路。
3） 发现肿瘤治疗相关的蛋白D型手性修饰
除了神经系统疾病，人类肿瘤的发生发展过程也与蛋白D型手性修饰密切相关。细胞程序性坏死是一种依赖于RIPK1激酶活性的坏死样细胞死亡模式。当细胞凋亡途径有缺陷时，坏死性凋亡被激活，主要由RIPK1, RIPK3和MLKL介导。前期核磁实验发现，RIPK1与RIPK3通过蛋白C端功能域形成同源或异源多聚蛋白复合体。通过合作实验，发现D型手性修饰会显著加剧细胞程序性坏死通路。李功玉课题组利用高分辨构象分辨质谱技术，成功解析了两种介导细胞程序性凋亡蛋白的异相组装路径，并首次定量表征了D型手性修饰在调控这种种组装过程中的决定性作用（Li* et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2023, e202314578）。
对于大多数实体肿瘤，化疗仍然是最有效的治疗方法之一。然而，大多数化疗药物毒副作用明显，给患者带来巨大的痛苦。多肽-化疗药物偶联物被誉为新一代抗癌之星，可以实现药物的精准递送，减少对健康组织的毒性损伤。同时，组装形貌丰富的自组装多肽更是被报道具有抗肿瘤转移、抗多药耐药等多种生物效应。因此，李功玉课题组还通过合作研究，设计了一种肿瘤原位响应的新型多肽-药物偶联物，通过肿瘤特异性形貌调控，实现了集“化疗增效”、“免疫激活”和“高效抗转移”于一体的all-in-one巧妙设计（Li* et al. Nano Today 2024, 102122）。目前正在尝试D型手性修饰对于该类药物的肿瘤疗效评估研究。