1. 研发超高分辨率成像平台对全基因组开放染色质结构进行三维解析

       传统的基因组三维结构研究多依赖于基于临近连接的Hi-C技术，本研究基于单分子定位显微成像技术开发出了一套超高分辨率成像技术(命名为3D ATAC-PALM)来对全部开放染色质的三维结构进行解析。通过给寡核苷酸片段标记光敏荧光基团，将传统的转座酶/ 开放染色质标记测序技术 (ATAC-seq) 转换为荧光标记的成像技术。通过选择基于光格栅显微镜搭建成像平台，在光路中加入柱面镜，利用其散光特性，产生椭圆度和方向不同的点分布函数图像，从而对荧光基团轴向距离进行精确评估。基于以上一系列技术，申请人团队首次对全基因组开放染色质的三维精细结构进行了纳米尺度上的解析。整个成像过程可以捕捉到单个细胞核当中多于90%的开放染色质位点，x和y方向的分辨率约为20nm，z方向的分辨率约为50nm。通过对小鼠胚胎干细胞的成像分析，首次发现全基因组开放染色质在三维空间呈现簇状分布的现象。该技术为三维基因组研究提供了不同于传统方法的新型光学直接测量手段，相关成果在2020年发表于Nature Methods。

                                                               图 1. 研发超高分辨率成像平台对全部开放染色质结构进行三维解析

2. 基于超高分辨率成像技术发现基因组三维结构的未知调控因子并且研究其调控机理

       本研究首先通过超高分辨率成像揭示了Cohesin复合体的缺失会导致全基因组开放染色质发生大尺度的聚集和分隔，但是这种聚集现象背后的原因还不明确。通过药物初筛，申请人团队发现了BRD2 蛋白很有可能与Cohesin复合体协同调控染色体的三维折叠。为了进一步研究其调控机制，研究使用基因编辑技术构建了含有Cohesin和BRD2 泛素诱导降解系统的细胞系，综合运用了超高分辨率成像技术、基于高通量测序的 micro-C 基因组结构解析技术、DNA原位杂交和聚合物折叠的计算机仿真方法，对比研究了原始状态下和相关因子缺失情况下染色体三维结构的变化。研究结果揭示了BRD2与Cohesin复合体通过与DNA 结合，对染色体施加两种相互制衡的 “作用力” ，从而维持染色体折叠的动态平衡。该研究发现了参与基因组结构调控的未知因子BRD2并且阐述了其调控机制，相关成果在2022年发表于Nature Genetics。

                                                             图 2. 应用超高分辨率成像技术研究三维空间染色体折叠的调控机理

3. 基于超高分辨率成像和单细胞组学分析发现三维基因组结构调控基因共表达的机制

       在过去10年里，4D Nucleosome等研究项目的实施虽然详细阐明了基因组三维结构的折叠机理及其分子调控机制，并且发现了基因组局部结构的变化可以影响相关基因的转录与表达，却对基因组三维结构的生物学功能还不清楚。具体来说，基因组的三维结构对于基因转录是否存在一个普遍性的调控机制还不为人知。本研究首先利用单细胞RNA测序和单细胞染色质可及性测序，发现Cohesin复合体的缺失，除了会显著影响基因组的折叠，还会促进不同开放染色质结构域之内基因的共表达和染色质结构域之间的协同开放。基于此结果，研究者提出了“基因组三维结构参与基因转录共调控”的科学假设。随后，该研究进一步利用基于内含子顺序杂交(Intron seqFISH)的空间基因组学方法、单分子定位超高分辨率成像和活细胞单分子示踪等技术，在全基因组和染色体水平上证明了上述科学假设。与经典的增强子——启动子相互作用调控基因表达的方式不同，这是一种全新的基因调控方式。在结构上，这种调控方式是相关基因通过空间聚集实现相关基因的转录共调控；在功能上，转录共调控并不影响基因的表达量，但是调控相关基因在同一细胞中的表达关联程度。该研究发现了一种未知的基因调控模式，阐明了基因组三维结构调控基因共转录的普遍性机制，对于理解由于Cohesin复合物相关蛋白突变引起的一系列疑难杂症（例如狄兰氏综合征，Cornelia de Lange Syndrome (CdLS)）的致病机理并且研发相应的诊疗手段意义重大。相关成果在2024年发表于Nature Genetics。

                                       图 3.基于超高分辨率成像和单细胞组学分析发现三维基因组结构调控基因共表达的机制