恭喜博士生陆叶关于杂交鹅掌楸低温敏感性的研究论文在Plant Science上顺利发表！ - 课题组新闻

2024年2月2号，南京林业大学林木细胞工程课题组在Plant Science上发表了题为 Physiological and transcriptomic analysis revealed that the accumulation of reactive oxygen species caused the low temperature sensitivity of Liriodendron × sinoamericanum 的文章，揭示了低温胁迫导致杂交鹅掌楸叶片水分流失和光合能力下降，其中细胞氧化还原稳态失衡导致活性氧物质(ROS)的加速积累是其低温敏感性的重要原因之一。

对杂交鹅掌楸进行持续的低温胁迫处理，在12 h时大部分杂交鹅掌楸叶柄开始下垂。处理2 d后，叶柄下垂更为明显，叶片逐渐失水枯萎。叶柄下垂现象在3天后开始恢复。5d-7d叶柄已完全恢复到胁迫前的状态，但叶片失水程度增加，叶缘卷曲。在长期低温胁迫下(3d、5d、7d)，叶绿体膨大成不规则形状，基粒片层变形，基质片层重叠程度降低，淀粉粒数增加。此外在胁迫处理48h后，净光合速率、运输速率、气孔导度和水分利用效率均呈显著降低趋势。但值得注意的是，低温处理48 h后，气孔导度和运输速率显著下调；与对照组相比，24 h后水分利用效率开始显著下降；净光合速率在低温胁迫12 h后显著下降，24 h后逐渐恢复，48 h后又显著下降。综上所述，经过短期(12-24 h)低温胁迫后杂交鹅掌楸对低温的适应能力有所提高，但长期低温胁迫会导致叶片失水增加，对光合系统造成损害。

图1. 低温诱导下杂交鹅掌楸表型及生理变化

为了评价杂交鹅掌楸叶片在低温胁迫下的损伤程度，我们检测了叶片中活性氧含量的动态变化，以及反映植物耐受性的生理指标。在低温胁迫下，杂交鹅掌楸叶片中活性氧和过氧化氢含量逐渐积累。低温胁迫12 h后MDA水平继续升高，表明叶片膜超氧化物合成增加，细胞损伤加重。进一步测定了酶防御系统中过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性。结果表明，POD酶活性在冷胁迫12 h后显著升高，达到峰值，随后逐渐降低。最后，在48 h时，酶活性远低于对照组。CAT酶活性在12h和48h呈逐渐升高的趋势，说明它可能在清除活性氧的过程中起到一定的作用。低温胁迫24 h后，SOD酶活性开始显著降低，表明活性氧可能在叶片中积累，影响细胞稳态。因此，这些数据表明，低温胁迫损害了杂交鹅掌楸叶片的活力。

图2. 连续低温胁迫下杂交鹅掌楸叶片活性氧含量的动态变化

时序转录组数据分析表明,在短期低温胁迫(48h)期间谷胱甘肽转移酶(GST)和谷胱甘肽还原酶(GSR)均呈现先升高后降低的趋势，说明杂交鹅掌楸对低温(12h)表现出一定的抵抗能力。植物激素信号转导途径的显著性富集表明在低温胁迫下植物激素的传导可能影响杂交鹅掌楸的低温耐受性。在ABA信号通路中，鉴定出2个ABA受体(PYL2和PYL2-like)、5个PP2C、4个SnRK2s和3个ABF基因，发现在胁迫处理的不同时间点上调表达。茉莉酸（JA）可以激活植物的防御机制，使其在逆境中生存。低温胁迫下JA生物合成途径相关的基因JAR1、MYC2和JAZ表达量上调。这一结果表明，茉莉酸是持续积累的，可能在杂交鹅掌楸对低温胁迫的响应中发挥了重要的调节作用。另外，13个光合相关基因呈现出先上升后下降的趋势，说明杂交鹅掌楸在短期低温胁迫下可以通过内部调控机制抵抗低温的影响，但随着胁迫时间的增加，伤害会逐渐加深。

图3. 鹅掌楸低温胁迫时间序列转录组统计分析

图4. 不同表达模式基因间KEGG富集分析

为了探究低温胁迫下杂交鹅掌楸叶片中ROS的变化，我们研究了参与ROS合成和降解的基因的表达模式。其中，呼吸爆发氧化酶同源物(RBOHs)可以影响O^2•-的合成，随着胁迫时间的增加，两个RBOH基因呈逐渐上调的趋势，一个RBOH基因呈逐渐下调的趋势。超氧化物歧化酶(SOD)和多胺氧化酶(PAO)能够影响H₂O₂的合成，其中SOD可以降解O^2•-转化为稳定的H₂O₂, PAOs催化多胺转化为H₂O₂。本研究共鉴定到3个SOD编码基因和1个PAO编码基因，其中SOD编码基因下调，PAO编码基因上调。结果表明，低温胁迫下O^2•-的降解减少，H₂O₂的合成增加(图5b)。过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APXs)和谷胱甘肽过氧化物酶(POD)等多种酶作为植物抵御胁迫的防御机制，在清除H₂O₂中发挥作用。低温胁迫下，两个CAT编码基因的表达均被高度诱导上调。两种APX编码基因表现出相反的表达模式，说明在低温胁迫下，杂交鹅掌楸叶片中 APX编码基因通过还原H₂O₂来解毒。在鉴定的14个POD编码基因中，8个在处理48小时后表达下调。其他成员在胁迫下表达模式呈现波动，但总体上差异不大。这些结果表明，杂交鹅掌楸在低温胁迫下的氧化还原稳态被打破，ROS的过度积累是其受损的重要原因之一。

图5. 低温胁迫下杂交鹅掌楸叶片中ROS合成及降解途径相关基因的表达模式

为了探究低温胁迫下诱导细胞内ROS爆发的转录调控机制，我们分析了437个差异转录因子的表达谱，相关性分析显示，329个转录因子与ROS合成和降解途径中编码酶的基因显著相关。进一步对这些高度相关的转录因子进行分类，发现它们可分为7类(MYB(26)、WRKY(14)、bHLH(28)、HD-ZIP(10)、NAC(14)、bZIP(16)和其他(221))，其中bHLH、MYB和WRKY的表达谱呈现出上调、下调、再上调的模式。同时分析单个基因成员的表达谱发现，WRKY6、WRKY11、WRKY24和MYB6在低温胁迫下不同时间点上调，并持续保持高表达水平。WRKY22、MYB4、MYB53在低温胁迫后呈现下调表达的趋势。bZIP和HD-ZIP基因的表达模式先下调后上调再下调。这些基因的表达模式与光合作用相关基因的表达模式相似，说明这些基因可能不直接参与鹅掌楸抗低温胁迫的过程。有趣的是，NAC基因在低温诱导下呈现出连续不断的上调模式，表明它们可能是鹅掌楸耐低温胁迫的正调控因子或负调控因子。低温诱导下NAC72、NAC73a、NAC16、NAC2和NAC68a的表达量迅速升高。此外，与MYB、WRYK等持续上调的转录因子相比，NAC72和NAC73a的表达水平上调最为强烈，这表明这两个转录因子可能直接参与了杂交鹅掌楸低温胁迫的防御机制。

图6. 低温胁迫下活性氧合成与降解转录调控基因分析

为了进一步验证上述猜想，我们克隆了杂交鹅掌楸中LsNAC72和LsNAC73a的编码序列，并构建过表达载体(35S:LsNAC72和35S:LsNAC73a)。为了进一步验证上述基因的过表达是否会影响杂交鹅掌楸叶片的氧化还原稳态，我们测量了低温胁迫下叶片的相关生理参数。结果表明，室温处理下，NAC72和73a的过表达会影响过氧化氢的积累和MAD含量的增加，并显著降低细胞中SOD酶的活性。这一趋势在低温胁迫下更为明显。说明叶片膜脂质过氧化程度增加。但在胁迫下的某些时间点，相关参数变化不显著，这可能是瞬时转染过程中农杆菌感染不均匀所致。因此，我们结合上述数据，选择在低温胁迫48 h后的转基因植株，分析其活性氧和过氧化氢含量的变化。染色结果表明，与室温处理植株相比，过表达LsNAC72和73a使过表达植株叶片中O^2•-和H₂O₂含量略有增加。而在低温胁迫下，过表达LsNAC72和73a显著促进了叶片中O^2•-和H₂O₂的积累。结合转录组数据，筛选一些与ROS合成和降解途径相关的基因，在48 h低温胁迫下进行验证。结果表明，35S:LsNAC72和35S:LsNAC73a可以下调LsPOD42、LsSOD1和LsSOD3的表达水平，上调LsAPX1的表达水平。LsNAC72可以正向调节LsPAO5的表达。这两种NAC转录因子之间不存在相互调控关系。上述结果表明，LsNAC72和LsNAC73a可能通过改变杂交鹅掌楸细胞氧化还原稳态来影响其对低温的适应性。

图7. 过表达LsNAC72和LsNAC73a瞬时遗传转化对杂交鹅掌楸叶片活性氧合成的影响

该研究成果由南京林业大学林木细胞工程课题组完成，博士生陆叶和胡凌峰为该论文的共同第一作者，陈金慧教授和施季森教授为共同通讯作者。该工作得到国家自然科学基金（32071784、31971682）和江苏省自然科学基金青年基金（BK20210614）的联合资助。

编辑：胡凌峰、郝兆东

Reference:

Ye Lu, Lingfeng Hu, Long Yu, Shuang Liang, Haoxian Qu, Mingqi Wang, Zhaodong Hao, Liming Yang, Jisen Shi, Jinhui Chen. Physiological and transcriptomic analysis revealed that the accumulation of reactive oxygen species caused the low temperature sensitivity of Liriodendron × sinoamericanum. Plant Science, 2024. doi: 10.1016/j.plantsci.2024.112020

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