2024年1月4号，南京林业大学林木细胞工程课题组在International Journal of Molecular Sciences上发表了题为H2O2 Significantly Affects Larix kaempferi × Larix olgensis Somatic Embryogenesis 的文章，首次建立并优化了杂交落叶松（Larix kaempferi × Larix olgensis）的体胚发生体系，并发现过氧化氢是影响杂交落叶松体胚发生的关键因素。
本研究以杂交落叶松未成熟胚为外植体，在高浓度的2,4-D培养基上诱导胚性胚柄团（embryonal-suspensor mass, ESM）诱导3个月左右，能够形成状态较好的I型ESM，然后在增殖培养基上培养数十天，可以获得II型和III型的ESM。
图1. 杂交落叶松合子胚胎发生（A-F）和体胚发生（G-R）
图2. I（A）、II（B）和III型（C）杂交落叶松ESM结构
杂交落叶松ESM的诱导效率较低，最高不过2%左右，使用的是授粉76天后收集的种子，对应图1F中的晚期子叶胚时期。在ESM转移到体胚诱导培养基上15天之后，可以看到形成透明的胚体结构和一个淡黄色的胚头（图1M）；培养30天后，形成柱状胚（图1N），随后进一步发育成子叶胚（图1O），整个再生过程大概需要45天。之后，将成熟子叶胚转移到DCR培养基上，诱导体胚萌发。光照7天后，子叶变绿；一个月之后，真叶长出（图1P）。接着，再转移至生根培养基中（含IBA和NAA），培养60天左右可以获得带根苗（图1Q、R）。
表1. 杂交落叶松ESM诱导效率统计
杂交落叶松体胚发生效率受体胚培养基的渗透压影响，200 g/L的PEG能够促进杂交落叶松体胚发生（图3A）。另外，适当浓度的“胁迫”激素脱落酸（10～15 mg/L）也能够促进杂交落叶松体胚发生（图3B）。进一步研究显示，单独添加ABA会抑制ESM分化（图4B、E）；单独添加PEG抑制增殖，促进分化，但是会停滞在原胚时期，不能进一步发育（图C、F）；同时添加ABA和PEG的培养基上，ESM能够增殖且分化形成原胚，并进一步发育成子叶胚（图D、G）。综上，PEG有助于杂交落叶松ESM转变发育命运，分化形成原胚，而ABA有助于原胚进一步发育，形成子叶胚。
图3. PEG（A
）和ABA（B）对杂交落叶松体胚发生的影响
图4. PEG和ABA单独以及联合处理对ESM的影响
另外，杂交落叶松ESM发育和体胚发生受到碳源的显著影响。葡糖和麦芽糖有助于ESM分化形成体胚，但是葡糖不利于体胚发育至成熟子叶胚。麦芽糖是杂交落叶松ESM增殖和体胚诱导的最佳碳源。
图6. 不同碳源条件下诱导形成的体胚和正常子叶胚数量
杂交落叶松ESM经过长时间继代培养后，会逐渐分化形成3类ESM（图7A-C）。其中，第2类ESM不能够在体胚诱导培养基上形成体胚，第1类和第3类ESM可以，而且第1类ESM形成的体胚数量远高于第3类。由于第3类ESM表现出轻微的褐化现象，通过过氧化氢含量的测定，发现第3类ESM中的过氧化氢含量的确远高于第1类ESM。
图7
. 不同类型ESM的体胚发生效率和过氧化氢含量比较
进一步通过对第1类和第3类ESM使用过氧化氢和DMTU处理，发现过氧化氢浓度越高，杂交落叶松体胚发生效率越低；同时，ROS清除剂DMTU能够降低第3类ESM中的过氧化氢含量，并显著增加第3类ESM的体胚发生效率。说明，ROS是影响杂交落叶松体胚发生的重要因素之一，ROS清除有助于提升杂交落叶松体胚发生效率。
图8. 过氧化氢对杂交落叶松体胚发生的影响
该研究成果由南京林业大学陈金慧组和中国林科院林业所孙晓梅组共同合作完成，硕士生朱俊杰为该论文的第一作者，陈金慧教授和孙晓梅研究员为共同通讯作者。该工作得到国家自然科学基金（32071784）、江苏省自然科学基金青年基金（BK20210614）和江苏省高校优势学科建设工程（PAPD）的联合资助。
编辑：郝兆东
Reference:
Junjie Zhu, Kaikai Zhang, Huiru Xiong, Yunhui Xie, Rui Li, Xinru Wu, Yun Yang, Hua Wu, Zhaodong Hao, Xiaomei Sun, Jinhui Chen. H2O2 Significantly Affects Larix kaempferi × Larix olgensis Somatic Embryogenesis" International Journal of Molecular Sciences, 2024, 25: 669. https://doi.org/10.3390/ijms25010669
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