1.高通量、高分辨原位结构解析技术
目前蛋白质原位结构的解析主要依赖Cryo-ET，然而，这种方法需要收集每个区域的倾转序列，使原位样品的数据收集效率严重降低，因此原位课题通常难以开展。
为了实现高通量、高分辨率的原位结构解析，课题组开发了新型原位结构解析方法-isSPA，在这个方法里，我们将非目标蛋白的密度视为非高斯噪声，在单张高剂量的电镜图像中直接探测目标蛋白，我们推导了最优蛋白质探测函数，极大地提高了在图像中识别目标蛋白的效率。此外，我们还开发了一个排序函数，能有效地消除模型偏差对分辨率的影响。由于不需要收集倾转序列，isSPA较断层方法的数据收集通量提高了至少30倍。
课题组与北京理工大学张法、万晓华课题组合作，对isSPA方法进行了GPU加速-GisSPA，GPU加速将计算效率提高了300-500倍。目前，课题组应用GisSPA已经解析了红藻细胞切片中的藻胆体和光系统II的结构（分辨率分别达到了3.4和3.9埃）和酵母细胞切片中的核糖体结构（分辨率为2.9埃）。
若使用GisSPA，请引用以下论文：
https://doi.org/10.52601/bpr.2021.210001
https://doi.org/10.1016/j.xinn.2021.100166
https://doi.org/10.1038/s41467-023-36175-y
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更新版本：https://github.com/ZHANGXinzheng-LAB/GisSPA_v2.0
2.分块重构算法
大型蛋白质复合物，尤其是病毒，受到柔性效应和埃瓦尔德球效应的影响，难以使用通常的冷冻电镜单颗粒分析方法取得准原子分辨率的结构。为了矫正埃瓦尔德球效应和蛋白质柔性的影响，课题组开发了分块重构算法——Block-based Reconstruction。在这个算法里，研究人员把蛋白质复合物的整体颗粒按照对称性分解成多个块。对每块利用仿射变换计算出对应的亚颗粒并进行局域优化与重构。结合拼合方法，分块重构显著地提升了单颗粒分析重构蛋白质的能力。在几十种大型病毒或较大的蛋白质复合物上应用分块重构，显著地弥补了柔性造成的密度畸变，并在多种病毒上突破了埃瓦尔德球效应极限，达到准原子级分辨率。
若使用分块重构，请引用以下论文：
https://doi.org/10.1038/s41467-018-04051-9
百度网盘链接: https://pan.baidu.com/s/1XBvFMsVCNLHAQ0y7APBbQw 提取码：6ose
3.针对多块结构拼接程序的使用说明
在进行冷冻电镜三维重构时，若复合物或某种病毒结构太大，具有Ewald球效应或者较为柔性，则可用分块重构算法[Zhu et al., Nat. Commun., 2018]计算以达到更高的分辨率。但对于分成多块后的，在每块结构单独优化后，块和块之间经常会出现一个随机的角度和位移偏移，导致各块之间无法直接拼合，无法得到完整的结构。而在三维空间对每一个不同的块进行fitting，获得相应的角度和位移，进而对三维块的结构进行角度和位移的补偿之后，可以通过原来的拼接算法获得完整重构。然而，三维空间的角度和位移矫正导致验证的sampling error，最终导致三维密度图密度明显变差，尤其是当分辨率接近奈奎斯特极限时更为严重。因此，赵明洁和朱东杰开发出一个可以在重构过程中修正每块之间旋转和位移（来自Chimera的块之间的3D fitting）的程序，使各部分完美拼接，最终使这个拼接的复合物或病毒整体上呈现出高分辨结构。
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4.应用界面电荷制备冷冻电镜样品的方法
由于在冷冻电镜样品制备过程中，无论是气液界面还是二维膜/溶液界面，其界面的电荷性质是导致界面吸附蛋白质颗粒以及形成取向优势的根本原因。在冷冻制样过程中，蛋白质吸附在气液界面上是由于界面上的负电导致的，并非传统认为的气液界面的疏水性质造成的。当调制气液界面使其带正电时，该界面同样会吸附蛋白质颗粒，但吸附在带正电的气液界面的蛋白质颗粒和吸附在带负电的气液界面的蛋白质颗粒具有完全不同的优势取向。并且，由于常见的气液界面通常是带负电的，因此，本方法提供的一种应用界面电荷制备冷冻电镜样品的方法，通过应用界面电荷，对界面上的电荷进行调制，促使界面电荷性质发生改变，从而改善吸附于界面上的样品颗粒的取向分布，并通过在三维重构的过程中合并不同电荷条件下的数据进行计算，从而有效改善蛋白颗粒的取向优势问题。对于自身不带电的二维膜和溶液的界面，通过化学修饰的方法，使二维膜和溶液的表面带有不同性质和数量的电荷，促使其更为普适的吸附蛋白质颗粒，从而调节蛋白质取向分布的能力，进而去解决界面的蛋白颗粒取向优势问题。
本方法提供了一种应用界面电荷制备冷冻电镜样品的方法。其中界面包括气液界面以及二维膜（石墨烯膜等）与液体形成的界面，其步骤包括：设置冷冻制样仪的温度和湿度，在制样容器中利用液氮对液态乙烷预冷；取载网固定在冷冻制样仪上，将样品溶液滴加至载网上，除去多余样品溶液，在载网上下两面形成液膜；将载网插入预冷后的液态乙烷中玻璃化；其中，在冷冻电镜样品制备过程中，在液膜的上界面或/和下界面应用电荷进行界面电荷修饰和界面电荷的改变。
本方法提供的一种应用界面电荷制备冷冻电镜样品的方法，能够解决传统冷冻电镜样品制备方法中常出现的冰层过厚、不吸附样品颗粒以及取向优势等问题。
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5.冷冻电镜的低降温速率样品制备方法
对包埋在玻璃体冰中的生物样品进行冷冻电镜成像时，样品被高能电子束照射会产生持续的漂移，这种现象被称为束诱导漂移（Beam-induced motion, BIM）。BIM会模糊数据的高频信号，限制高分辨结构的解析；并且使易受辐照损伤氨基酸的结构无法获得。我们发现BIM和样品制备时的降温速率相关，降低样品制备的降温速率可以有效消除样品的束诱导漂移。改善现有冷冻制样方法后，我们通过提升冷冻媒介的温度以及在微栅上形成降温速率梯度的方法，成功得到了无BIM的单颗粒样品。
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