工程益生菌作为底盘菌已广泛应用在活菌药物治疗和生物制造领域，然而微生物群落中抗生素耐药基因的传播使益生菌在应用过程中面临安全性危机。CRISPR-Cas系统作为高特异性的DNA降解工具被应用于耐药基因消减，但表达传统的II型CRISPR-Cas9为大肠杆菌带来较高的生长负荷和毒性。为开发更安全的底盘益生菌，本研究组成功将大肠杆菌来源的I-E型CRISPR-Cas3系统整合入益生大肠杆菌Nissle 1917（EcN），并将其靶向到流行的耐药基因序列上，包括多粘菌素耐药基因 mcr-1， 碳青霉烯耐药基因bla_NDM-1 和四环素耐药基因tet(X)，EcN中的工程CRISPR-Cas3可达到99.86%（体外）和96.65% （斑马鱼体内）的耐药质粒消除率。此外，I-E型CRISPR-Cas3系统对于EcN的生长负荷显著小于II型CRISPR-Cas9。本文报道的I-E型CRISPR-Cas3工程EcN可在益生菌活菌治疗或生物制造应用中降低耐药性积累和传播的风险，推动EcN作为安全底盘菌的临床应用。