DOI：https://doi.org/10.1093/rb/rbad111
摘要
图形摘要：高强韧纤维钛 (FG Ti) 通过表面拓扑结构促进pBMP2活性基质的转染有效增强骨整合，共同展现出细菌抑制作用。
四川大学聂宇研究员团队研究成果：
钛作为外科植入物材料具有很多优点，因而在医用金属材料中占有重要地位。植入体的表面生物活性对于术后与周围骨组织的整合和长期稳定性至关重要。其中，DNA活性基质涂层 (DAM) 的修饰方法在骨整合方面具有很好的潜力，但确受到骨髓间充质干细胞 (BMSCs) 转染效果不佳的限制，难以进一步实现体内应用和临床转化。
四川大学聂宇研究员团队在高强韧纤维钛 (FG Ti) 表面构建了一种由相变溶菌酶 (P) 为粘合剂、富含精氨酸的阳离子脂质 (RLS) 为转染剂、携带骨形态蛋白2 (BMP2) 质粒DNA (pBMP2) 的DAM涂层。其中RLS在BMSCs上的转染效率较商品试剂 (Lipofectamine 2000和PEI) 提高了30倍，钛表面的纤维拓扑结构还能进一步促进转染效率到75.7%。与此同时，纤维拓扑结构仍然能对成骨细胞具有接触诱导效应。
进一步研究发现，FG Ti的纤维拓扑结构通过重塑细胞骨架有助于pDNA的摄取，促进MSC细胞的迁移，从而增强了骨整合效果。同时，阳离子RLS和粘合剂P均具有抗菌性能，减少了微生物的粘附并破坏了细菌结构，能有效抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。
修饰的高强韧纤维钛 (FG Ti-P/pBMP2-6) 植入大鼠股骨髁缺损模型后，因其高效的基因递送性能、表面纤维拓扑结构、以及显著的细菌抑制作用，成功实现快速骨愈合。
研究内容简介
为了提高钛植入体的骨整合效率，在骨科手术中广泛应用了蛋白质涂层，特别是BMP2蛋白涂层。然而，这种涂层存在体内快速消除和易失活的问题，因此需要使用高于正常剂量的蛋白质，这可能引发神经系统、急性呼吸系统和炎症等问题。
为了实现钛植入体长期的功能性和稳定性，我们采用了逐层组装 (LBL) 技术，并在高强韧纤维钛 (FG Ti) 表面构建了一种DNA活性外基质 (DAM) 涂层。该涂层旨在调控MSC的细胞骨架，以最大限度地发挥其生物学活性，并实现更好的骨整合效果。DAM主要由相转移溶菌酶 (P)、阳离子脂质 (RLS) 和质粒骨形态发生蛋白2 (pBMP2) 通过静电相互作用力自组装而成。在该研究中，P作为一种强粘附剂，并且具备广谱抗菌活性。与此同时，富含精氨酸的RLS不仅保证了良好的基因转染效果，还展现出对细菌的显著抑制作用。最后，FG Ti-P/pDNA-6植入体通过物理表面拓扑结构和化学DAM成分的协同作用，促进了骨整合能力。
一、纯钛表面DAM薄膜构建及理化性能表征
研究团队采用逐层组装技术制备了多层 (pDNA/RLS)n薄膜。通过静电相互作用，我们成功地在纯钛/硅晶片基底上构建了DAM薄膜，并吸附了具有足够量的pDNA，约为 2646.8 ng/cm2，总层厚为 107.57 nm。随着 DAM 薄膜的逐层组装，形成更大的纳米团簇聚集体，表面粗糙度略微增加，薄膜的组装过程保留了基底的拓扑特征，且基底对组装过程影响不大。同时， (pDNA/RLS)6的杨氏模量显著降低，更加接近天然骨的机械性能 (15 MPa) ，这有助于降低应力屏蔽效应 (图1)。
图1 钛表面DAM薄膜的制备与表征。(A) DAM制备示意图。(B) FE-SEM。(C) AFM。(D) 均方根粗糙度 (Rq)。(E) 杨氏模量。(F) 接触角。(G) UV-Vis。(H) QCM-D。
二、DAM薄膜基因转染、细胞形态、迁移和基因摄取
体外转染实验的结果表明，DAM涂层成功地将pEGFP传递到BMSCs和MC3T3-E1细胞中，实现了高效的基因递送效率。同时，钛表面的纤维拓扑结构对基因转染起到了积极的促进作用。在BMSCs细胞中，基因递送效率达到了75.7% (图2A和2B)。这可能是通过纤维拓扑结构重塑细胞骨架，从而调控细胞的粘附、扩散、延伸、迁移和内吞过程所实现的。细胞骨架实验以及细胞迁移和基因摄取实验结果进一步验证了这一假设。
细胞骨架实验结果显示，在FG Ti上涂覆 (pDNA/RLS)6薄膜前后，约有90%的细胞沿着RD方向展开 (图2C和2D)。DAM修饰后，由于聚电解质多层膜提供了更相容的细胞黏附界面，细胞铺展的长径比和面积显著增加。细胞迁移结果表明，在FG Ti基底上，细胞倾向于沿着平行于钛晶粒的方向迁移。此外，FG Ti-P/pGL3-6上的细胞表现出增强的迁移能力，这有助于通过细胞骨架重排，影响内吞作用和DNA的核位移，从而提高基因转染效率 (图2E和F)。最后，荧光图和流式细胞仪结果进一步证实了FG Ti表面的纤维拓扑结构有助于细胞对基因的摄取。定量分析结果表明，在FG Ti组中，Cy5阳性细胞的比例达到了84.4%，高于CG Ti组的68.5% (图2G和H)。
因此，FG Ti-P/pDNA-6的高基因传递效率可能源于多层膜中高负载的pDNA、优秀的RLS载体以及有利的纤维拓扑结构。
图2 DAM在不同Ti样品上的转染效率及接触引导效应。(A) 荧光显微镜观察在BMSCs和MC3T3-E1细胞上的转染效率。(B) 转染效率半定量分析。(C) CLSM观察BMSCs细胞骨架。(D) 细胞取向分析。(E) 细胞迁移图和定量分析，包括迁移速度和净位移。(F) CLSM观察细胞在CG Ti和FG Ti的基因摄取。(H) 流式细胞术定量分析基因摄取。
三、DAM薄膜基因表达、成骨分化能力评估
考虑到前文提到的DAM系统在基因传递方面的有效性，我们对治疗性pBMP2的表达进行了评估，包括mRNA和蛋白质水平的检测。通过Q-PCR和WB分析，我们证实了DAM成功地将pBMP2传递到靶向细胞，并翻译为蛋白质 (图3A、3B和3C)。我们还通过RT-PCR检测了成骨相关基因的表达情况 (图3E)。不同的成骨分化基因在到达表达峰值的时间点上有所差异。总体而言，DAM对ALP、Runx2、Col1a、OCN和OPN等基因的表达都具有不同程度的促进作用。此外，FG Ti-P/pBMP2-6组的表达水平也高于CG Ti-P/pBMP2-6组。这表明，特定的纤维拓扑结构和DAM协同增强了pBMP2的转染效果，从而促进了成骨。
图3 成骨分化能力。(A) Q-PCR分析BMP2在mRNA水平上的表达水平。(B) WB分析BMP2蛋白表达水平。(D) 茜素红染色。(E) Q-PCR分析成骨标志基因表达水平。
四、DAM薄膜体外抗菌性能评估
细菌感染是阻碍骨快速整合的重要因素之一。一旦细菌附着在种植体表面，它们会逐渐形成菌落和生物膜，从而破坏种植体的功能。琼脂糖平板扩散实验结果显示，DAM修饰能显著降低细菌的粘附 (图4A、4B和4C)。随着DAM膜上RLS含量的增加，FG Ti-P/pDNA-6对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制率分别达到90%和80%，其抗菌作用可能与RLS和P分子的掺入有关。进一步分析细菌在材料表面的形态和数量发现，FG Ti-P/pDNA-6表面细菌附着明显减少，部分菌膜破裂并伴随着细菌内容物渗出。相反，裸露的钛表面上存在大量细菌附着，细菌细胞膜保持完整光滑。这可能是由于材料表面的疏水性在早期植入阶段阻止了细菌的附着。当细菌附着在材料表面时，带有正电荷的RLS和P分子与细菌膜中的磷脂头基团相互作用，导致膜的变形，从而为宿主细胞的附着提供了有利的微环境 (图4D)。进一步对细菌内部结构的分析发现，在RLS处理后，大多数大肠杆菌周围形成囊泡，细胞内含物明显减少，细菌壁受到破坏。然而，在金黄色葡萄球菌中，只观察到细菌细胞质内容物的凝结和沉淀，这可能是由于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的外膜结构差异所致 (图4E)。
图4 体外抗菌性能评估。(A) 琼脂糖平板法评估不同钛样品处理后大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌落形成情况。(B) 定量分析大肠杆菌抑菌率。(C) 定量分析金黄色葡萄球菌抑菌率。(D) FE-SEM观察细菌形态。(E) TEM观察细菌内部结构。
五、DAM薄膜修饰纤维钛植入物在大鼠股骨髁缺损模型中的体内治疗效果评估
研究团队进一步探讨了DAM薄膜修饰的纤维钛植入物在大鼠股骨髁缺损模型中的体内治疗效果。通过Micro-CT显微扫描、重建和分析，我们对DAM涂层修饰的植入体周围新生骨进行了评估。结果显示，pBMP2修饰的FG Ti展现出最佳的新骨形成效果，骨小梁密度紧凑且完全包裹在种植体周围 (图5A)。相关的定量统计结果也验证了FG Ti-p/pDNA-6在体内具备卓越的骨修复性能。此外，即使在没有治疗基因的情况下，FG Ti-p/pEGFP-6比FG Ti组也形成了更密集的骨小梁，这表明DAM薄膜具有降低应力屏蔽效应的潜力 (图5B)。
图5 植入后第3周和第6周，钛植入物周围骨整合情况。(A) Micro-CT三维重建图像。(B) 定量分析骨形态学参数，包括BV/TV、BMC、BMD、Tb. N，Tb. Th，Tb. Sp。
在植入缺损部位第六周时，通过骨组织形态学观察，我们也观察到了类似的骨整合趋势 (图6)。甲苯胺蓝染色结果显示，FG Ti-P/pBMP2-6周围存在广泛的蓝色区域，表明骨连续性最佳 (相较于FG Ti增加了2.3倍)。其次是FG Ti-P/pEGFP-6 (相较于FG Ti增加了1.6倍)。相比之下，FG Ti植入体周围的新骨生长较为稀疏 (图6A、6C和6D)。最后，CA和TE的骨组织荧光标记结果也证实了FG Ti-P/pBMP2-6具有最佳的新骨形成和矿化能力 (图6B和6E)。综上所述，FG Ti-P/pBMP2-6种植体的骨结合速度最快，这是纤维拓扑结构和软DAM薄膜共同作用的结果。
图6 不同钛种植体在术后6周的骨整合效果。(A) 甲苯胺蓝染色。(B) CA和TE标记植入物周围新骨形成图像。定量统计 (C) 新骨面积和 (D) 骨-植入物接触率。(E) 骨矿化沉积率。
六、结论
在本研究中，我们报道了一种有前途的表面介导的基因治疗策略，旨在解决钛植入物的表面生物活性问题。该策略结合了具有生物相容性的DAM和良好纤维拓扑结构的钛种植体 (FG Ti)。新构建的DAM系统能够有效负载和激活足够量的pDNA，增强转染效率。同时，表面的纤维拓扑结构通过重塑细胞骨架进一步促进了细胞对pDNA的摄取，从而提升治疗效果。这种协同效应使我们成功克服了在难转染细胞 (BMSCs) 上的障碍，最终实现了高达75.7%的转染效率。此外，FG Ti-P/pDNA-6植入物，通过阻止细菌粘附并破坏内部结构，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有显著抑制作用。最后，与治疗基因联合，FG Ti-P/pBMP2-6植入物成功实现快速骨愈合。综上所述，在植入物表面介导的基因治疗领域中，实现化学和机械因素调节之间的和谐平衡具有重要的意义。
课题组简介
通讯作者
聂宇，四川大学国家生物医学材料工程技术研究中心/生物医学工程学院博士研究生导师，研究员，德国洪堡学者，四川省学术和技术带头人。专注微纳仿生生物材料设计在基因递送、肿瘤治疗和组织再生方面的研究和开发应用。主持6项国家级科研项目及多项省部级、校企合作项目；在Advanced Materials, Advanced Functional Materials, ACS Nano, Advanced Science 等期刊发表SCI论文80余篇，他引2200余次，H因子30，授权国内外发明专利21项，参与多部生物材料专著编写；创建“中-德科学家合作研究组”平台，组织4次中德生物材料高端论坛等。目前担任Pharmaceutical Nanotechnology副主编、Acta Pharmaceutica Sinica B 青年编委、Chinese Chemical letters青年编委、Asian Journal of Pharmaceutical Sciences青年编委，担任国家药品监督管理局医疗器械技术评审专家、中国专利审查技术专家、中国生物材料学会-智能仿生生物材料分委会委员、四川省生物医学工程学会理事、四川省药学会纳米药物专委会委员等。
金蓉蓉，四川大学国家生物医学材料工程技术研究中心/生物医学工程学院硕士研究生导师，副研究员。长期从事诊疗一体化磁共振探针的设计合成、生物安全性评价及临床转化应用，共发表SCI论文50余篇，文章他引次数1800余次，H因子23。授权国内外发明专利13项，参与3部生物材料专著编写。主持多项国家级、省部级及校企合作项目。
李娟，四川大学华西口腔医 (学) 院博士研究生导师，教授。主要研究方向是骨及软骨组织工程、生物力学以及数字化口腔医学。主持国家自然科学基金项目5项、省部级项目3项，发表SCI学术论文60余篇,获临床专利10余项，担任30多个国际杂志审稿人。
第一作者
贺婷，四川大学硕士研究生。
资助信息
本工作获得国家自然科学基金 (No.81873921和82372027)，中德科研合作研究项目 (GZ1512)，四川省国际科技创新合作项目 (2023YFH0060)，成都市科技计划 (2020-GH02-00007-HZ) 和四川大学华西口腔医院跨学科创新项目 (RD-03-202305)，四川大学-泸州市战略合作项目 (2023CDLZ-11) 的资助。
原文信息
Ting He, Yichun Wang, Ruohan Wang, Huan Yang, Xueyi Hu, Yiyao Pu, Binbin Yang, Jingyuan Zhang, Juan Li*, Chongxiang Huang, Rongrong Jin*, Yu Nie*, Xingdong Zhang, Fibrous topology promoted pBMP2-activated matrix on titanium implants boost osseointegration, Regenerative Biomaterials, Volume 11, 2024, rbad111, https://doi.org/10.1093/rb/rbad111
原文链接
Fibrous topology promoted pBMP2-activated matrix on titanium implants boost osseointegration | Regenerative Biomaterials | Oxford Academic (oup.com)
https://academic.oup.com/rb/article/doi/10.1093/rb/rbad111/7486573