文献分享：Hematopoietic aging promotes cancer by fueling IL-1⍺–driven emergency myelopoiesis

文献分享：造血老化通过刺激IL-1 β驱动的紧急骨髓生成促进癌症

（22级硕士邹艾伶）

今天我要分享的这篇文献于2024年9月发表于国际顶尖学术期刊Science上，其通讯作者是来自西奈山伊坎医学院的Miriam Merad教授，Merad教授在树突状细胞和巨噬细胞生物学领域中处于领先地位，尤其专注于它们在人体疾病中的作用。她首次发现了组织驻留巨噬细胞谱系，并揭示了其在器官生理和病理生理中的独特功能。除巨噬细胞研究外，Merad博士还因其对树突状细胞的研究而闻名，她发现了一种新的树突状细胞亚群，现被视为抗病毒和抗肿瘤免疫的关键靶点。

本文的背景是基于衰老是癌症最重要的总体风险因素之一，虽然很多研究已经提出了关于衰老与癌症发病率增加之间联系，但依旧缺乏对衰老、炎症和肿瘤发生之间关联的细胞基础的研究。本文作者以非小细胞肺癌（NSCLC）为例，试图阐明衰老对宿主对NSCLC发展和结果的反应影响的原因，因为NSCLC与衰老高度相关，且是癌症相关死亡的最常见原因。

文中提到的肺泡巨噬细胞（AMs）是发现于肺泡内的单核吞噬细胞。它们吸收外来颗粒，降解、清除抗原并呈递给适应性免疫细胞。

图中展示出肺泡巨噬细胞的两种来源，一是来源于粒-单核细胞祖细胞（GMP），一是来源于单核细胞-树突状细胞祖细胞（MDP）。

结果1 尽管衰老小鼠骨髓生成增强，但其肺中肺泡巨噬细胞仍然减少。

作者首先观察了年轻和老年小鼠的自然状态下肺之间存在的差异，发现与7周龄小鼠的肺相比，72周龄小鼠的肺表现出显著的肺泡细胞密度减少和肺实质内血管渗漏增加。随后，作者检测了与肺衰老相关的其他指标，并测量了参与免疫监视的细胞，他们发现老年小鼠的肺显著缺乏树突状细胞（DCs）和效应淋巴细胞，包括肺的NK细胞和血液中的CD8及CD4+T细胞。此外，在树突状细胞中，作者观察到1型常规树突状细胞（cDC1）的减少，而cDC2未见明显变化；相反，单核细胞来源的树突状细胞（moDC）在老年小鼠的肺中富集。

由于组织驻留的肺泡巨噬细胞（AMs）可以反应肺的功能，，作者使用Ms4a3CRE报告基因（Ms4a3TdT）小鼠，以区分骨髓的粒细胞-单核细胞祖细胞（GMPs）来源的表达tdTomato（TdTPOS）的AMs与胎儿/胚胎来源的Ams（TdTNEG）。通过流式细胞术，作者首先观察到肺中AMs的绝对数量显著下降（图1D），而其他GMP来源的髓系细胞数量并没有变化；尽管肺中中性粒细胞的数量增加，但单核细胞和间质巨噬细胞（IMs）并没有显著变化。AMs的这一显著下降主要是由于胚胎AMs的丧失，而成年单核细胞来源的AMs数量没有发生显著变化，这与对其他衰老组织中组织驻留巨噬细胞的类似分析一致。在老年小鼠中，循环（Ki-67POS）AMs的同时减少表明这些组织驻留的吞噬细胞自我更新能力降低。这些数据表面AMs的自我更新能力减弱，且在衰老过程中稳定状态的髓系发生无法补充因时间流逝而丧失的AMs。

接着，作者对年轻和年老小鼠的血液和骨髓中的造血干细胞和祖细胞（HSPC）以及成熟的髓系细胞（单核细胞和中性粒细胞）进行了量化。在血液中，Ly6CHI单核细胞的数量仅发生了适度变化，这与近期对年轻和老年健康供体循环经典单核细胞的研究结果一致。相反，在老年小鼠的血液中，Ly6CLO单核细胞和中性粒细胞显著增加，这也与其他人类研究的结果相符。随着年龄增长，这些在血液中积累的循环单核细胞大多是老年Ms4a3TdT小鼠的TdTNEG，表明它们主要来源于单核细胞-树突状细胞祖细胞（MDPs）。在老年小鼠的骨髓中，作者发现造血干细胞（HSCs）和髓系定向多能祖细胞（MPP2，MPP3）扩增，并且在共同髓系祖细胞（CMPs）、MDPs、GMPs、粒细胞祖细胞（GPs）和共同单核细胞祖细胞（cMoPs）中显著富集，同时淋巴系定向祖细胞（MPP4和共同淋巴祖细胞 [CLP]）的数量有所减少。老年小鼠的骨髓中，中性粒细胞和单核细胞的数量也显著增加，即随着年龄的增长，造血过程中的髓系偏倚取代了淋巴生成。总的来说，这些发现表明，尽管稳态衰老在骨髓中产生了更多的髓系祖细胞和分化的髓系细胞，这些细胞可能准备响应招募信号，但在衰老的肺，AMs仍然出现了显著减少。

结果2 老年小鼠的肺癌进展增强

接下来，作者首先探讨了衰老如何影响肿瘤微环境（TME）并影响肺肿瘤的生长。作者使用了基于KrasG12D/+Trp53−/−Rosa26A3Bi Rag1−/−（KPAR）细胞移植及原位生长的非小细胞肺癌（NSCLC）模型。该模型使作者能够特定评估宿主小鼠的衰老对肿瘤生长的影响。在接种后1天，基于年轻（7.KPAR）和老年（72.KPAR）小鼠肺实质中GFP表达肿瘤细胞的存在，早期定植和启动阶段并没有观察到显著差异。然而，在进展的后期，老年小鼠的肿瘤负担显著高于年轻小鼠。与此同时，老年小鼠肺肿瘤中细胞毒性CD8 T细胞和活化NK细胞的频率均有所降低。相反，在髓系细胞中，老年小鼠的肺肿瘤中中性粒细胞和单核细胞显著富集。在进一步分析单核细胞-巨噬细胞谱系时，作者观察到年轻和老年小鼠在肿瘤生长期间AMs数量的稳态下降。相应地，单核细胞来源的巨噬细胞（mo-macs）在老年小鼠中的积累显著高于年轻小鼠。这些变化与老年小鼠的生存时间短于年轻小鼠的情况相关。

在肺中，作者还识检测到许多髓系祖细胞样细胞（肺MPs），其定义为CD45POS LinNEG[CD11b, Ly6G, CD3, B220, Ter-119, NK1.1] Sca-1NEG c-KitPOSCD135NEG FcɣRII/IIIPOSCD34POS细胞，存在于年轻和老年小鼠的肺肿瘤中。肺MPs同样高度表达Ly6C和CD115，这表明它们与骨髓中真正的cMoPs共有单核细胞表型。通过静脉注射标记循环中的CD45POS细胞，作者能够区分肺中的血管外和血管内免疫细胞，结果表明肺MPs基本未被标记（即大多数位于肺实质内），确实是一个局部群体。在老年荷瘤的Ms4a3TdT小鼠中，作者确认肺MPs是肿瘤生长过程中来源于成体髓系生成的，并且能够增殖。

与年轻小鼠相比，老年小鼠中肺MPs的扩增最为显著，甚至在接种肿瘤细胞后10天时，就已经出现了明显扩增，尽管此时尚未观察到年轻和老年小鼠之间的肿瘤负荷显著差异。此外，作者注意到无论有无肿瘤信号，老年小鼠的骨髓中GMPs均显著扩增，但在老年小鼠肺观察到的肺MPs的显著积累仅受到肿瘤信号的驱动。总之，这些发现指向了紧急髓系生成反应的加剧，这与老年小鼠更差的肿瘤预后相关。

结果3 免疫系统的衰老是肺癌进展的主要驱动因素

这些免疫学差异是否是导致肺癌年龄依赖性进展的唯一原因仍不确定。先前的研究已报道衰老的基质区在肿瘤形成中的促肿瘤作用，因此作者设计了不同年龄的骨髓移植（BMT），以确定肺肿瘤微环境中免疫及非免疫生态系统的衰老是否是宿主衰老对肺癌生长影响的原因。简单来说，将来自年轻或老年小鼠的供体骨髓转移到年轻或老年受体小鼠，这种方法得到了先前工作的证明，该研究证实造血干细胞（HSCs）对年龄不匹配的骨髓生态位具有抵抗重编程的能力。经过八周的移植期后，小鼠接种KPAR细胞，并在接种后第10天和第20天评估肿瘤负荷。值得注意的是，早在第10天，接受老年骨髓的小鼠表现出最大的肿瘤负荷，并且在第20天时这一结果具有统计学意义。重要的是，接受年轻骨髓的老年受体的小鼠其肿瘤负荷与接受年轻骨髓的年轻小鼠相当，这表明免疫细胞的衰老对肺肿瘤生长有显著影响。

相较于接收年轻骨髓的小鼠，接收老年骨髓的小鼠肺肿瘤生长增强，同时这些小鼠中的增殖性调节性T细胞（Tregs）数量增加，细胞毒性CD8 T细胞数量减少，以及活化的NK细胞显著减少。在肿瘤形成的早期，相较于老年受体小鼠，年轻受体小鼠的肺AMs数量较多，这可能反映了尚未因新生微病灶而受到干扰的稳态AMs的存在。然而，接收老年骨髓的小鼠肺的mo-macs频率已显著高于接收年轻骨髓的任何组别，这表明携带老年免疫系统的小鼠早期经历了强烈的应急造血反应。到了后期，当肿瘤建立后，接收老年骨髓的小鼠肺AMs的频率显著减少，肿瘤负荷最大。相反，所有小鼠的肺都累积了mo-macs，但在接收老年骨髓的年轻受体小鼠中，这种扩张最为明显，与这些小鼠的NK细胞反应较差相一致。最后，作者观察到，接收老年骨髓的小鼠在接种后仅10天内，即使在年龄依赖性肿瘤负荷差异尚未显著的情况下，肺MPs显著增加。

为了证明年轻免疫系统的重建是否能够拯救老年小鼠对与年龄相关的肺肿瘤生长的抗肿瘤反应，作者比较了接收年轻或老年骨髓的老年受体小鼠。在这种情况下，作者发现接收年轻骨髓的老年小鼠的肿瘤负荷显著低于接收老年骨髓的小鼠（图2G）。与这一检测结果相符，作者发现接收年轻骨髓的老年荷瘤小鼠的肺MPs、mo-macs和中性粒细胞数量减少。总而言之，这些数据确定造血衰老足以通过增强肿瘤诱导的紧急骨髓生成来促进肺癌进展——独立于非免疫基质的衰老。

结果4 IL-1⍺特征定义了老年小鼠肺肿瘤中的髓系祖细胞样细胞

作者进一步表征年轻和年老小鼠肺TME中的免疫细胞。作者对从年轻和老年荷瘤小鼠肺分选的33,572个CD45POS细胞进行了scRNA-seq。无监督聚类将污染的非免疫细胞分离，从而获得了年轻和老年小鼠肺TME的首个比较单细胞图谱。这包括T细胞、NK细胞、B细胞和髓系细胞。与年轻荷瘤小鼠相比，老年荷瘤小鼠肺的干细胞样CD4 T细胞和活化NK细胞的频率降低，而在老年小鼠的肺肿瘤中，mo-macs显著富集，且这些肿瘤相关的mo-macs广泛表达Trem2，作者将肿瘤细胞接种Trem2敲除小鼠。与作者之前关于Trem2的研究一致，这些小鼠的肿瘤负荷显著低于WT。由于Trem2在小鼠或人类的肺肿瘤微环境的非免疫细胞中均不表达，这些数据支持了髓系细胞对老年小鼠肺癌生长增强的具有重要贡献这一观点。

通过scRNA-seq，作者还识别到肺髓系祖细胞的局部群体，这些细胞共同表达Csf1r、Csf2ra、Csf3r、Cebpe和Klf4，并缺乏成熟髓系细胞的标记物。肺髓系祖细胞包括中性粒细胞祖细胞（NeuP;Ly6g）、粒细胞祖细胞（GranuloP; Mmp8、Ccl6、S100a8、S100a9）和单核细胞祖细胞（MonoP; Clec4n、Csf1r、Bhlhe40）。为了阐述它们与骨髓相应细胞的关系，作者将肺髓系祖细胞的转录组与荷瘤小鼠骨髓中的GMP、GP和cMoP进行比较。发现NeuP、GranuloP和MonoP与其骨髓祖细胞相比，与肺肿瘤微环境中成熟髓系细胞有着很大的转录相似性，这表明肺髓系祖细胞可能代表了成熟单核细胞和mo-mac上游的的髓系祖细胞。并且，与通过流式细胞术的方法进行的量化相一致，作者发现老年小鼠的肺肿瘤中表达肺髓系祖细胞mRNA程序的细胞显著富集。

接着，作者比较累两种不同年龄小鼠NeuP、GranuloP和MonoP的差异表达基因（DEGs），发现老年中上调的基因包括Ier3、Wfdc21、Txnip和Socs3等。由于这些标记物在肺髓系祖细胞上游的祖细胞（如造血干细胞HSC、具多向分化能力的祖细胞MPP和粒系祖细胞GMP）中的表达通常更高，所以这一结果提示老年小鼠肿瘤中的肺髓系祖细胞相较于年轻小鼠的肺髓系祖细胞成熟度更低。进一步分析分化的髓系细胞时，作者发现，老年小鼠的Ly6CHI单核细胞的Prtn3、Lcn2和Chil3等基因表达水平高于年轻小鼠；由于这些标记物在骨髓髓系祖细胞和单核细胞中表达较高，这些DEGs也表明老年小鼠肺肿瘤中的Ly6CHI单核细胞在转录水平上成熟度低于年轻小鼠的相应细胞。在比较老年小鼠与年轻小鼠中广泛存在的Trem2 mo-macs时，作者发现老年mo-macs表达的Trem2共调控的基因水平更高。

在肺MPs中，MonoP在老年小鼠的肺肿瘤中显著富集，并且绝大多数肺MPs是单核样细胞，所以作者接下来重点分析MonoP。与其他肺MPs相比，MonoP表达编码Il1a和Il1rn的mRNA水平显著升高，以及编码生存相关分子如BCL-xL（Bcl2l1），髓系细胞寿命的调节因子（Morrbid）、细胞周期的负调节因子和衰老标记物p21（Cdkn1a），以及其他BCL-2家族成员（Bcl2a1b、Bcl2a1d）也升高。MonoP转录的Il1a引起了作者的特别关注，因为该转录在这些细胞中高度特异，而Il1b则在所有肺MPs和mo-macs中普遍表达。值得注意的是，IL-1受体1（IL-1R1，由Il1r1编码），作为IL-1⍺和IL-1β的配体受体，在TME的局部免疫细胞中缺失。作者通过ELISA确认，IL-1⍺和IL-1β在老年荷瘤小鼠肺的蛋白水平上高度上调。老年小鼠肺肿瘤中这两种细胞因子的高水平进一步使作者对IL-1在老年小鼠肺癌进展中功能相关性的研究更加合理。

结果5 阻断 IL-1⍺：IL-1R1 信号传导可延缓肺癌进展

作者首先通过测量肺MPs相对于分化的髓系细胞在蛋白水平上产生的IL-1⍺和IL-1β来验证转录组数据。肺MPs产生的IL-1⍺水平最高，而IL-1β主要由肺肿瘤中的中性粒细胞产生。值得注意的是，老年小鼠荷瘤肺的肺MPs所产生的IL-1⍺和IL-1β均显著高于年轻小鼠，这表明造血衰老增强了它们的产生。为了确定这一点的功能相关性，作者进行了IL-1⍺和/或IL-1β的抗体阻断实验，并将这些疗法与IL-1R1拮抗剂anakinra进行了比较，后者可以同时干扰IL-1⍺和IL-1β信号传导。由于研究显示，肺MPs在肿瘤形成早期即积累在肺肿瘤中，因此作者在肿瘤细胞接种后24小时开始治疗。IL-1⍺的阻断比IL-1β的阻断更强力地延缓了肺癌的进展；值得注意的是，两者的组合显示出明显的协同作用，减少肿瘤生长的效果与使用anakinra治疗小鼠相当。并且anakinra治疗在老年小鼠中显著提高了生存率，这与增强的肿瘤杀伤性NK细胞反应有关。比较anakinra在年轻和老年小鼠中的有效性时，作者发现IL-1R1拮抗作用在老年小鼠中产生了治疗效果，这一效果出现在年轻小鼠之前，因为在接种后第16天观察到老年小鼠有反应，而年轻小鼠则没有。这些效果体现在尽管在疾病过程中开始的时间不同，年轻和老年小鼠生存率都被显著改善。

为了理解破坏IL-1R1信号传导如何减轻年龄增强的肺肿瘤生长，作者试图识别表达IL-1R1的细胞类型。作者首先考虑了IL-1⍺/β对肿瘤细胞本身的直接信号传导，因为它们表达IL-1R1。在肿瘤细胞中删除Il1r1后，作者发现这些缺乏IL-1R1的细胞在体内的生长与IL-1R1表达正常的肿瘤细胞相当；宿主的衰老仍然促进了IL-1R1缺失肿瘤的进展。为了确定IL-1R1表达正常的肿瘤细胞与缺失肿瘤细胞之间的生长适应性是否存在差异，作者还评估了在共同微环境中IL-1R1表达正常和缺失的肿瘤的生长情况。作者使用CRISPR-Cas9技术生成IL-1R1表达正常或缺失的肿瘤细胞，以等比例混合后，注射到小鼠体内，并使用循环免疫荧光染色法标记蛋白标签，以区分IL-1R1表达正常的肿瘤细胞与缺失的肿瘤细胞。作者没有发现两种基因型之间的肿瘤有显著的适应性优势。这表明，在局部微环境中，IL-1⍺的可能的响应者是那些占据肿瘤微环境的非癌性免疫和非免疫细胞。

在蛋白水平上，作者发现IL-1R1主要由非免疫细胞在局部TME中表达，包括癌症相关成纤维细胞（CAFs）、上皮细胞和内皮细胞。虽然作者的骨髓移植研究已经突显了造血衰老在年龄依赖性肺癌进展中的独特重要性，但尚未排除IL-1R1阳性非免疫细胞（如CAFs）在间接介导免疫抑制性髓系细胞招募到TME中的独立于年龄外的因素。为了探讨这一点，作者将年轻或衰老的骨髓移植到年轻、与年龄匹配的Il1r1+/+（野生型）和Il1r1−/−受体小鼠体内，然后用KPAR细胞植瘤。作者观察到携带年轻骨髓的Il1r1−/−小鼠的肿瘤负担较其野生型同类显著降低，在带有衰老免疫系统的小鼠中，非免疫部分的IL-1R1基因缺失（Il1r1−/−受体）表现出的肿瘤负担与野生型受体相当。与这一观察结果一致的是，尽管在携带衰老骨髓的Il1r1−/−受体小鼠中肺MP的数量减少，但mo-mac和Tregs的数量在衰老骨髓的Il1r1+/+和Il1r1−/−受体小鼠之间相当。这些发现突显了在衰老免疫系统的存在下，IL-1信号对免疫细胞的促瘤作用远远强于其在年轻免疫系统中的作用。

作者还测试了来自应激非免疫细胞的IL-1⍺是否会促进与年龄相关的肺癌进展，考虑到其作为由细胞压力、损伤或衰老释放的警报素的典型功能。与上述涉及Il1r1−/−受体的小鼠的移植研究类似，作者将年轻或衰老的供体骨髓移植到Il1a+/+（野生型）或Il1a−/−受体小鼠体内。部分接受老供体骨髓的Il1a−/−受体小鼠还接受了anakinra治疗。作者观察到，携带年轻免疫系统的Il1a−/−小鼠的肿瘤负担显著低于野生型受体小鼠，但作者发现，在衰老免疫系统的背景下，遗传性缺失非免疫细胞中的IL-1⍺对肺肿瘤生长没有影响。这向作者提示，造血衰老可能会代偿非免疫细胞IL-1⍺的缺乏。此外，作者发现，anakinra治疗显著延缓了衰老供体骨髓的Il1a−/−受体小鼠的肺癌进展，这表明anakinra的抗肿瘤效力取决于来自免疫来源的IL-1⍺信号的中断，且作者明确指出，这主要由局部肿瘤微环境中的肺MP贡献。

这些数据和转录组分析的结果显示局部免疫细胞几乎不表达Il1r1，作者进一步探讨了能够对IL-1做出反应的外周免疫细胞。通过流式细胞术，作者确定了骨髓的造血祖细胞在老鼠的荷瘤肺中表达显著高于局部先天免疫和适应性免疫细胞（这些细胞的IL-1R1表达水平很低）。即使在未免疫的小鼠中，作者发现骨髓的造血祖细胞的IL-1R1蛋白和mRNA水平也高于分化的髓系细胞（如中性粒细胞、单核细胞）和淋巴细胞（如B细胞，后者在局部肿瘤微环境中显示出最高的IL-1R1水平）。虽然已知IL-1β可直接作用于造血干细胞（HSCs）并促进髓系分化，但IL-1⍺对HSCs的影响研究较少。因此，作者对一个公共数据集进行分析发现，在用IL-1⍺处理的HSCs中，主要髓系基因（如Ms4a3、Chil3、Ly6c2、Csf2rb、Itgam和Ly6g）显著上调，这表明IL-1⍺也促进HSC向髓系谱系的定向分化。

为了确定在阻断IL-1信号传导后应急造血是否会恢复正常，作者检查了经过anakinra治疗的小鼠的骨髓和肺。作者首先测量了造血干细胞（HSCs）中的磷酸化p38（phospho-p38）水平，以确定anakinra是否降低了IL-1信号传导及其他与肿瘤发生相关的MAPK激活信号对HSCs的影响。结果显示，anakinra治疗的荷瘤老鼠的HSCs中磷酸化p38水平显著降低，而骨髓中GMP也降低至与年轻荷瘤小鼠相当的水平。小鼠经过anakinra治疗后，肺的MP和mo-mac数量也显著减少，这表明在肿瘤起始期间阻断IL-1信号传导可以抑制HSC向GMP谱系的转化以及GMP衍生细胞向肿瘤微环境的招募。这些表型在年轻小鼠中也可观察到，但仅在大约一周后才出现。这些数据表明，来自肺MP的IL-1信号传导与骨髓中的造血祖细胞形成了老鼠应急造血的主导通路。

结果6 癌前（用药）时间决定了阿那白滞素最佳疗效的治疗窗口。

为了验证anakinra用药时间点的重要性，作者测试了延迟anakinra给药是否会影响其疗效。作者比较了在第14天接受anakinra治疗的老鼠（4剂，成瘤后治疗）与未治疗对照组和在成瘤之前（接种后第1天开始，共9剂）按照作者原始方案接受anakinra治疗的老鼠的肿瘤生长情况。根据研究，推迟anakinra治疗并没有减少老鼠的肿瘤负担。作者还在老年基因工程小鼠中测试了这些条件，这些小鼠在接受了诱导Cre重组的腺病毒后发展为KrasG12D/+Trp53−/−肺癌。在该条件下，接种后18周开始治疗的（已成瘤的老鼠）与对照组老鼠的肿瘤负担相当；这与接种后第1周开始anakinra治疗的老鼠形成差异，表明在癌前阶段/肿瘤起始期间抑制IL-1⍺信号传导是阻止肺肿瘤生长的唯一时机。

结果7 通过IL-1R1 信号传导的年龄增强骨髓生成促进多发性小鼠癌的生长。

为了扩大对IL-1⍺/IL-1R1轴在年龄增强的应急骨髓生成中的研究范围，作者希望确定这一衰老驱动的癌症进展机制是否在其他肿瘤中也会有相同的表型。作者通过原位移植，用结直肠癌和胰腺癌探究年龄对肿瘤发病的影响，结果与肺癌发展一样。

结果8 造血衰老过程中 DNMT3A 的减少增强了 IL-1⍺的产生。

由于MP的Il1a转录是在肺组织中发生的，作者想探究可能在TME中引发肺MPs这一反应的局部信号。作者假设MPs暴露于细胞碎片可能促使其在肺肿瘤中产生IL-1⍺。为了检测这一假设，作者采用了一种简化的体外系统，暴露骨髓单核细胞（这些细胞在转录上类似于肺MPs）于凋亡细胞碎片，并测量IL-1⍺的产生。作者将低剂量LPS（脂多糖）对TLR4的标准激活产生IL-1α作为阳性对照。结果显示，老年单核细胞对TLR4激动剂的敏感性高于年轻单核细胞，产生的IL-1⍺水平明显更高。作者还观察到，暴露于凋亡肿瘤细胞碎片的老年单核细胞比年轻单核细胞产生了更强的IL-1⍺反应。这一现象在骨髓祖细胞中同样成立。

这些说明了以下两点：(1) 细胞碎片能够诱导IL-1⍺的产生；(2) 血液造血衰老改变了单核细胞及其巨噬细胞（MPs）的细胞内表型，使其更倾向于产生更多的IL-1⍺。为了进一步探讨后者，作者分析了年轻和老年小鼠骨髓中分选的造血干细胞（HSCs）的全基因组RNA测序（bulk RNA-seq），以识别与衰老相关的转录差异。从该分析中，作者发现老年HSC显著下调了DNA甲基转移酶3A（Dnmt3a），这一mRNA表达的下降也可以在作者独立分析的其他两个外部数据集中观察到。这一发现对作者具有重要意义，因为DNMT3A的功能丧失突变是不确定克隆性造血（CHIP）的主要驱动因素，这是一种在老年人中常见的高度炎症性疾病，且与肺癌风险密切相关。

另外一些基因，如Tet2和Asxl1，尽管突变也会导致CHIP，但未表现出类似的减少。作者通过流式细胞术在年轻和老年小鼠中确认了这一蛋白水平的下调；观察到老年小鼠骨髓HSC的细胞核内DNMT3A水平随年龄下降。作者还在对其他健康供体的HSC的数据集的分析中确认了DNMT3A在稳态下的下降。作者还测量了无癌症的健康年轻供体和老年供体血液中循环HSPCs的DNMT3A水平，以及来自NSCLC患者的HSPCs，在这些患者中，作者记录到HSPCs的频率随年龄和病情恶化而增加。在这两组HSPCs中，作者观察到老年个体的DNMT3A水平下降。这些数据不仅表明随着年龄的增长紧急造血的程度增加，还确认了即使在癌症患者中，DNMT3A的年龄相关下降。

接下来，作者比较了缺失DNMT3A的细胞与其WT对照。作者对Dnmt3a−/−和Dnmt3a+/+（WT）HSC进行全基因组RNA测序（bulk RNA-seq）的独立分析，发现在许多主要转录变化中，DNMT3A缺失导致与髓系偏向相关的基因如Cdkn1a、Itga3、S1pr1和Vdr的上调，以及Runx3、Flt3和Irf7的下调。DNMT3A缺失还促进了Il1r1的转录，突显了DNMT3A功能丧失可能增强HSC对来自肺巨噬细胞的循环IL-1⍺的响应。为了进一步探究DNMT3A缺失的影响，作者分析了小鼠Dnmt3a−/−和WT中的GMP的RNA测序数据。在这里，突变GMP显著上调了几个与单核细胞表型相关的基因（如F13a1、Il4ra、Gpnmb、Ccr2、C1qa）以及与不成熟相关的基因（如Cd38、Flt3、Chil3、Ly6a），并上调了Il1r1，这表明造血祖细胞中的DNMT3A功能丧失导致产生更多对IL-1信号增强敏感的髓系祖细胞。作者还分析公共的Dnmt3a−/−和WT单核细胞/单核巨噬细胞的RNA测序数据集时，发现缺失DNMT3A会导致Il1a、Il1b、免疫调节分子（如Cd274、Pdcd1lg2）、髓系谱系标记（如Vcan、Ms4a3、Mpo、Elane、Retnlg、S100a8、S100a9、Prtn3）以及与免疫抑制相关的代谢酶（如Arg1、Acod1、Hmox1）的上调。这些标记物中的许多是IL-1⍺程序的差异表达基因（DEGs），在对人类DNMT3A缺失和正常单核巨噬细胞的分析中也是显著的靶标。实际上，其他上调的标记物包括①不成熟标志物（如CD38、CD48、CSF2RB），②先天免疫感应标志物（如CGAS、NLRP3、MYD88），③细胞存活标志物（如BCL2L1、CDKN1A、TNF），以及④免疫抑制表型标志物（如CD274、TGFB1、IL18BP、NFE2L2），这些标志物具有招募其他单核细胞或Tregs的潜力（如CCL5、CCL7）。这些变化表明，DNMT3A在小鼠和人类中以保守的方式调节IL-1⍺及更广泛的髓系表型。

为了实验验证这些转录数据，作者使用了一种对DNMT3A具有高度特异性的强效小分子抑制剂，处理来自年轻和老年小鼠的骨髓单核细胞。作者观察到，经过DNMT3A抑制剂处理并用低剂量LPS刺激的年轻和老年单核细胞均显著增加了IL-1⍺和IL-1β的产生，并且经过DNMT3A抑制剂处理的年轻单核细胞产生的IL-1水平与未处理的老年单核细胞相当。这一发现提示，降低DNMT3A活性可使衰老驱动的单核细胞产生IL-1的能力提高。相反，TNF-⍺的产生则表现出不同的特征；虽然可以观察到类似于IL-1⍺的与年龄相关的产量增加，但DNMT3A抑制增加了年轻单核细胞TNF-⍺（TNF-⍺也推动髓系偏向）的产生，而在老年单核细胞中没有这一效应。这些数据表明，DNMT3A下降引起的IL-1⍺的年龄相关调控并不一定适用于其他能够影响造血偏向的细胞因子。作者还发现这种DNMT3A与IL-1⍺之间的关系也适用于人类单核细胞。

结果9 IL-1⍺相关 mRNA 程序根据年龄和结果对患者进行分层

在最后一个结果中，作者希望探索所获得的研究结果在肺癌治疗中的潜在临床意义。由于PD-(L)1阻断仍然是NSCLC的首选治疗，作者评估了早期联合使用anakinra和PD-1阻断在老年小鼠中的疗效。他们发现这两种治疗方式的联合显著增强了肿瘤细胞的清除；虽然PD-1阻断改善了细胞毒性CD8 T细胞的反应，但与anakinra联合使用时，这种反应得到了进一步提升。此外，anakinra在恢复肿瘤杀伤性NK细胞反应方面发挥了独特作用，而这种反应不会由PD-1单独使用所导致。

随后，作者对已发表的35例未接受治疗的外科切除NSCLC病变组织细胞的scRNA-seq数据进行了分析，并对邻近正常组织和肿瘤组织中的免疫细胞进行了特征分析。在scRNAseq识别的主要免疫细胞类型中，作者发现IL1A和IL1B mRNA在经典单核细胞和巨噬细胞中最强烈表达。然而，更广泛的IL-1⍺ mRNA程序（使用标志基因IL1A、MORRBID、BCL2L1、CDKN1A、IL1RN、CLEC6A、SPP1定义）与TREM2巨噬细胞簇强烈相关。对其中一些基因的单细胞表达分析显示，存在一组独特的巨噬细胞表达IL-1⍺ mRNA程序（IL1APOS）。

这些IL1APOS巨噬细胞在NSCLC患者的原发性切除肿瘤中相较于正常组织显著富集。在年龄≥70岁的老年患者肿瘤中，这些肿瘤相关IL1APOS巨噬细胞的频率高于年龄<70岁的年轻患者；在邻近的正常组织中未见到这种与年龄相关的差异（p=0.94）。这些数据支持了作者对IL-1⍺ mRNA程序的研究，表明其作为与年龄相关的肿瘤分子特征。此外，作者发现更多的老年患者较年轻患者会出现疾病反复。并且，作者在复发患者的肿瘤中发现了肿瘤性IL1APOS巨噬细胞的显著富集，较未复发患者更为明显，这表明IL1APOS巨噬细胞在原发性切除肿瘤中的丰度与复发之间存在预测性关联。

最后，作者旨在评估更广泛的IL-1⍺ mRNA研究的预后价值。作者使用Kaplan-Meier估计和Cox回归进行的总体生存分析表明，IL-1⍺ mRNA程序的高表达者相较于低表达者预测具有更差的预后。接下来，作者测试了IL-1⍺ mRNA程序作为肺癌风险预测因子的有效性。在此，作者利用收集自个体的循环蛋白组，比较了肺癌患者与吸烟且年龄匹配的对照组之间1,000多种蛋白质的丰度水平，发现IL-1⍺和IL-1β都能预测肺癌风险的升高。

作者还希望研究IL-1⍺ mRNA在人体CRC中的相关性。作者通过单细胞RNA测序分析了31例CRC患者的肿瘤和未受累结肠组织。结果与前提到的NSCLC和正常组织相比相似。

以上便是本篇文章的全部结果，接下来用一张图总结这篇文章的主要内容：

编辑：2024级硕士罗红梅