文献分享:Erythropoietin regulates energy metabolism through EPO-EpoR-RUNX1 axis.

EPO 通过EPO-EpoR-RUNX1轴调节能量代谢

（23级硕士 欧阳杰）

作者背景介绍：

本文的第一作者是来自美国国立卫生研究院国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所分子医学分部的 Weiqin Yin。本文的通讯作者是 Constance T. Noguchi。Constance T. Noguchi 在 1999 年至 2022 年期间担任美国国立卫生研究院（NIH）FAES（科学高级教育基金会）研究院院长，目前担任学术顾问。Constance T. Noguchi 实验室当前主要研究促红细胞生成素在维持干细胞 / 祖细胞特性方面的作用。该实验室运用分子和细胞生物学、生物化学以及生物物理方法，对与细胞功能、分化和发育相关的分子结构及加工过程展开研究。重点聚焦于动物模型中增殖和分化的转录调控。实验室对促红细胞生成素受体的功能以及造血、神经元、肌肉、内皮、骨骼、脂肪量和其他干细胞 / 祖细胞的性别特异性调节中促红细胞生成素的代谢和应激反应特别关注。其他研究内容包括红细胞分化、珠蛋白基因表达以及镰状细胞病和其他血红蛋白病的相关病理生理学。

正文：

过去认为促红细胞生成素（EPO）主要与骨髓中红细胞祖细胞上的促红细胞生成素受体（EpoR）结合，从而调节红细胞产生，促进存活、增殖和分化。目前发现EpoR 不仅在红系组织表达，在非红系组织中也有潜在EPO-EPOR活性，如对大脑、心血管系统或骨骼肌损伤或缺血有保护反应。促红细胞生成素（EPO）在能量代谢中起着关键作用，白脂肪组织（WAT）中的促红细胞生成素受体（EpoR）表达介导了其代谢活性。本研究表明，脂肪组织缺乏 EpoR 的雄性小鼠呈现出脂肪量增加以及对饮食诱导肥胖的易感性。研究结果显示，EpoR 存在于 WAT、棕色脂肪组织和骨骼肌中。雄性小鼠 EPO 水平升高可改善葡萄糖耐量和胰岛素敏感性，同时降低 WAT 中脂肪生成相关基因的表达，这与转录因子 RUNX1 的增加有关，RUNX1 可直接抑制脂肪生成基因表达。对野生型雄性小鼠进行 EPO 处理可降低脂肪组织中的脂肪量和脂肪生成基因表达，并增加 RUNX1 蛋白，而在脂肪组织 EpoR 消融的小鼠中未观察到这种现象。EPO 处理降低了 WAT 泛素连接酶 FBXW7 的表达并增加了 RUNX1 的稳定性，这为 EPO 通过 EPO-EpoR-RUNX1 轴调节雄性小鼠能量代谢提供了证据。

作者通过利用Tg6 EPO过表达的转基因小鼠，与野生型（WT）同窝对照组相比，3 周龄的 Tg6 小鼠体重较低，脂肪量减少，而瘦体重无差异（图1a-d），这表明高促红细胞生成素（EPO）通过减少脂肪堆积或抑制脂肪形成来影响体重和脂肪量。Tg6 小鼠的高血清 EPO 还显著增加了血糖耐量和胰岛素敏感性（图 1e-h）。并且从脂肪细胞染色切片可以看到与 WT 小鼠相比，Tg6 小鼠的白色脂肪组织（WAT）和棕色脂肪组织（BAT）中的脂肪细胞更小（图 1i-k），这与 Tg6 小鼠的较低体重和脂肪量一致。而脂肪细胞大小对细胞功能和健康有重要贡献。与同窝对照相比，年轻的 Tg6 小鼠表现出血清瘦素、胰岛素和葡萄糖水平降低，脂联素水平升高，炎性细胞因子 TNF、INF-γ、IL-1α、IL-1β 和 IL-6 以及作为肝功能指标的 AST 和 ALT 水平相当。与饲喂高脂饮食（HFD）的 WT 小鼠相比，喂养 HFD 3 周的 Tg6 小鼠体重减轻，脂肪量减少，瘦体重无显著差异。与 HFD 小鼠的 WT 同窝对照小鼠相比，Tg6 小鼠的葡萄糖耐量也显著增加。与盐水处理相比，HFD 上的 WT 小鼠经过 3 周 EPO 处理也显示体重和脂肪量类似降低，瘦体重没有差异，葡萄糖耐量增加。此外，通过间接量热法进行的代谢测量未发现 WT 小鼠和 Tg6 小鼠之间有显著差异或瘦体重的任何差异，尽管 Tg6 小鼠在夜间似乎表现出活动减少。

作者利用安秀丽老师构建的 EpoR-tdTomato-Cre 小鼠中测定非红系 EpoR 的表达，结果显示，tdTomato标记的表达EpoR的组织中：脾脏、皮下白色脂肪组织（scWAT）和附睾白色脂肪组织（eWAT）比棕色脂肪组织（BAT）、大脑皮层、下丘脑、骨骼肌和肝脏要亮的多（图 2a ）。EpoR 表达的相对水平反映在 EpoR 阳性细胞的数量上（图 2b）、mRNA 表达上（图 2c），并且通过蛋白质印迹法得到了验证（图 2d、e）。白色脂肪组织中高水平的 EpoR 表达表明，EPO 可能主要通过 EpoR 表达靶向脂肪组织，并影响脂肪组织中脂肪的合成与分解。EPO 对其他器官的影响可能由 EpoR 表达直接介导，尽管其水平与白色脂肪组织相比显著降低，或者也可能是 EpoR 介导的白色脂肪组织对EPO的响应剪接影响其他器官的脂肪代谢。

线粒体解偶联蛋白 1（UCP1）与棕色脂肪组织（BAT）中的非颤抖性产热相关。与野生型（WT）小鼠相比，Tg6 小鼠的皮下白色脂肪组织（scWAT）中的 UCP1 增加（图 3a、b）。与雄性小鼠的 WT scWAT 相比，Tg6 scWAT 还显示出 BAT 相关基因（Ucp1、Pgc1α、Cidea 和 Prdm16）的表达升高（图3c）。然而，BAT相关基因的表达在附睾白色脂肪组织（eWAT）中与 WT 无差异（图3d）。这些结果表明，EPO-EpoR 轴可能通过促进 scWAT 的褐变来影响各个器官中脂肪的代谢。在 scWAT 中，与 WT 小鼠相比，高促红细胞生成素（EPO）显著增加了 Tg6 小鼠中脂肪分解基因（Pparγ 和 Lpl）的表达，降低了脂肪生成基因（Acc1/2、Fas、Lipin1、Srebf1 和 Scd1）的表达（图3e）。虽然 UCP1 和 BAT 相关基因的表达在 Tg6 eWAT 中未升高，但与 WT 小鼠相比，在 Tg6 小鼠的 eWAT 以及 BAT、骨骼肌和肝脏中观察到脂肪分解基因表达增加和脂肪生成基因减少（图 3F - I），尽管与 Tg6 scWAT 的变化相比水平降低（图 3e）。scWAT 中白色脂肪的褐变可能与脂肪合成减少有关。

为确定红细胞中 EPO - EpoR 轴的激活或瞬时 EPO 处理是否会影响脂肪代谢基因表达，作者利用∆EpoRE小鼠施用 EPO，发现EPO 治疗显著降低了 WT 小鼠的体重和脂肪量（图 4a、b），且对瘦体重没有影响，但EPO 治疗对只∆EpoRE小鼠的血细胞比容增加，对体重、脂肪量或瘦体重没有调节作用（图 4a、b），这提供了证据表明 EPO 对体重和脂肪量的影响是通过非红细胞 EpoR 介导的。与 PBS 处理相比，WT 小鼠经 EPO 处理后显著改变了脂质代谢基因，在皮下白色脂肪组织（scWAT）中脂肪分解基因 Pparγ 和 Lpl 的表达增加，但在∆EpoRE 小鼠的 scWAT 没有表现出这种调节作用。在 WT 小鼠的附睾白色脂肪组织（eWAT）、棕色脂肪组织（BAT）、骨骼肌和肝脏中也观察到 EPO 处理后 Pparγ 和 Lpl 表达增加，且与 scWAT 相比增加幅度较低（图 4c - e）。于此对比，在∆EpoRE 小鼠中，经 EPO 处理后，这些脂肪分解基因的相应表达差异很小（图 4c - e）。∆EpoRE 小鼠中脂肪生成基因表达没有相应变化，进一步强调了非红细胞 EpoR 在介导 EPO 调节脂肪量和脂质代谢中的作用。

作者通过多序列比对程序 Clustal Omega 对受 EPO 增加调节的相应脂肪分解和脂肪生成基因的 3000 bp 5' 启动子序列进行分析。通过 MEME 鉴定出脂解和脂肪生成基因启动子区域的两个保守基序，由 44 bp（潜在的 RUNX 结合基序）和 29 bp（潜在的 IRF 结合基序）组成（图 6a、b）。野生型（WT）小鼠和 Tg6 小鼠 scWAT 中 IRF 家族成员的基因表达没有差异。scWAT 中 RUNX1、RUNX2 和 RUNX3 基因在 WT 小鼠和 Tg6 小鼠中的表达也相似。由于 RUNX1 表达与白色脂肪的褐变有关，作者检查了 scWAT 中的 RUNX1 蛋白水平，发现与 WT 小鼠相比，Tg6 小鼠在 scWAT 中的 RUNX1 蛋白水平增加（图 6d），Tg6 小鼠的附睾白色脂肪组织（eWAT）、棕色脂肪组织（BAT）、骨骼肌和肝脏的 RUNX1 蛋白水平没有差异（图 6d），表明高 EPO 特异性影响 scWAT 中的 RUNX1 蛋白。通过 ChIP 验证显示，在 WT 小鼠的 scWAT、eWAT、BAT、肝脏和骨骼肌中，RUNX1 蛋白与脂肪分解基因 Pparγ 和 Lpl 以及脂肪生成基因 Acc1/2、Fas、Lipin1、Srebf1 和 Scd1 的启动子结合（图6h）。作者使用荧光素酶报告基因构建体证明 RUNX1 可以通过脂质代谢基因启动子区域的 RUNX1 结合基序调节转录，并且 EPO-EpoR 轴的激活进一步增加了 RUNX1 调节活性（图6i - l）。这些数据为脂质代谢基因的 EPO-EpoR-RUNX1 依赖性转录活性以及脂解基因启动子区 RUNX1 结合基序的相关增强子活性和 RUNX1 结合基序在脂肪生成基因启动子区的沉默子活性提供了证据。

泛素化是将小分子泛素添加到底物蛋白上的酶促翻译后修饰，对蛋白质稳态有重要贡献，调节许多蛋白质的细胞活性，并通过多泛素化靶向蛋白质进行蛋白酶体降解。由于 Tg6 小鼠的 RUNX1 蛋白较高，但在皮下白色脂肪组织（scWAT）中的 mRNA 水平与野生型（WT）小鼠相比没有差异，作者猜测RUNX1 蛋白的增加可能反映了促红细胞生成素（EPO）对 Tg6 小鼠 scWAT 中 RUNX1 泛素化和降解的抑制。E3 泛素连接酶是泛素化所需的三种酶之一，作者通过测试E3 泛素连接酶，如 MARCH1、MARCH5、TRIM 家族成员（TRIM1、TRIM21、TRIM23、TRIM26、TRIM27、TRIM32）、MYLIP、MKRN1、COP1 、 PELI3 FBXW7，发现只有FBXW7 E3 泛素连接酶的 mRNA 表达显著降低（图7a），并且 FBXW7 基因编码的 FBW7 蛋白水平在 Tg6 小鼠的 scWAT 中也比 WT 小鼠降低（图 7b）。与 WT 小鼠相比，Tg6 小鼠的 scWAT 中 K48 连接的聚泛素信号的相应水平也降低（图 7c）。这些数据表明，FBW7 可能通过靶向 RUNX1 经由泛素化信号通路降解来控制脂肪细胞代谢，并且 EPO 通过降低 scWAT 中的 FBXW7 mRNA 和 FBW7 蛋白含量来升高RUNX1蛋白含量。因此，FBW7 将是能量和脂质代谢的重要调节因子。促进泛素蛋白酶体系统的 FBW7 E3 泛素连接酶增加会增加 RUNX1 降解，而 EPO-EpoR 轴的激活会降低 K48-多泛素并增加 RUNX1 蛋白的稳定性。

综上所述，人源EPO是在scWAT 中通过EPO-EpoR-RUNX1 轴来调节细胞中与脂肪合成和分解相关基因的表达情况，进而调节scWAT 中能量的代谢，最后表现出小鼠体重和脂肪量的降低。该机制确切描述了EPO首先通过EPO- EpoR抑制 FBW7 基因的转录翻译情况， FBW7蛋白降低导致RUNX1 蛋白的泛素化水平降低，进而导致由RUNX1 转录调节所介导的与脂肪分解基因表达的升高和脂肪生成基因表达的降低，影响scWAT 能量代谢，降低小鼠体重和脂肪量。

编辑：2024级硕士罗红梅