文献分享：IL-6 Blockade Reverses Bone Marrow Failure Induced by Human Acute Myeloid Leukemia.

文献分享：IL-6阻断可逆转人急性髓系白血病引起的骨髓衰竭

（24级硕士 曹惠）

急性髓系白血病(AML)是一种侵袭性血液癌症，是骨髓(BM)或外周血(PB)中异常髓系祖细胞不受控制的增殖和积累引起。大多数AML患者死于BM衰竭导致的血细胞减少引起的并发症。

传统的临床教学认为，AML相关的BM衰竭是由于白血病细胞对BM生态位的物理拥挤造成的，但许多白血病负荷较低、BM腔不完全受累的AML患者也会表现出BM衰竭的临床症状。许多研究调查了AML对正常祖细胞和生态位的影响，表明AML分泌因子的产生是驱动生态位功能障碍的潜在机制。但由于缺乏概括人类疾病过程的模型，研究AML引起的BM衰竭背后的机制受到阻碍。

2020年8月，斯坦福大学Ravindra Majeti团体在《Science Translational Medicine》杂志上发表了题为：IL-6 Blockade Reverses Bone Marrow Failure Induced by Human Acute Myeloid Leukemia的研究论文。该研究开发了一种原发性人类AML异种移植模型，准确地概括了AML诱导的BM衰竭导致总生存期缩短，并发现了导致红细胞分化受阻的关键旁分泌因子IL-6，同时证明了临床批准的抗IL-6阻断抗体可以逆转IL-6的效应，从而提高异种移植模型的总体存活率。

图1 AML患者血细胞减少的严重程度与疾病负担无关

Fig.1 The severity of cytopenias in patients with AML is independent of disease burden.

普遍认为，AML引起的骨髓衰竭是由于AML原始细胞过度拥挤骨髓空间所致。研究者进一步推测，如果空间拥挤是导致AML诱导的骨髓衰竭的主要机制，那么骨髓拥挤的程度应与血细胞减少的严重程度呈一定关系。因此，作者调查了2011-2014年间在斯坦福大学诊断为AML的293名患者的临床数据，发现BM原始细胞百分比与血红蛋白浓度、血小板计数、中性粒细胞绝对计数或淋巴细胞绝对计数之间并不存在相关性（图1 A-D），说明AML白血病负担和骨髓空间拥挤并不是AML引起的骨髓衰竭的主要驱动因素。

图2 脾切除的人类AML异种移植小鼠死于BM衰竭

Fig.2 Splenectomized human AML xenograft mice die of BM failure. 

研究者在NSG-PDX小鼠中进行了人AML细胞的异种移植（图2 A），发现：NSG-PDX小鼠在移植后12周仅表现出轻微的细胞减少，没有骨髓衰竭的迹象，即使骨髓白血病植入率超过60%也是如此(图2 B、C)。对这些小鼠的尸检分析表明，与仅接受照射的对照组NSG小鼠相比，NSG-PDX小鼠出现脾肿大(图 2D)。观察NSG-PDX小鼠脾脏的组织学切片，可以看到巨核细胞数量显著增加，并且红髓出现扩张。（图2 E）

研究者进一步开发了一种异种移植方法（图2 F），通过这种模型发现：只有经过AML静脉注射的NSGspln—-PDX小鼠会发生全血细胞减少，而进行切脾但注射正常祖细胞（NSGspln--CB-CD34+）的小鼠，或者经过假手术注射AML细胞（NSGsham-PDX）的小鼠，两者的血红蛋白含量无显著差异（图2 G）。这一现象表明，NSGspln--PDX小鼠由于AML诱导的BM衰竭而出现全血细胞减少症，导致早期死亡，再现了人类疾病。并且，贫血程度与疾病负担不相关（图2 H）。

图3 正常小鼠HSPC在人类AML存在时被耗尽

Fig.3 Normal mouse HSPCs are depleted in the presence of human AML.

使用已建立的标记通过流式细胞术计数了来自NSGspln--PDX小鼠的HSPC（图3 A），发现，与对照组相比，NSGspln--PDX小鼠的所有祖细胞群均减少（图3 B-F），并且，进一步探讨HSPC与AML植入的关系，发现HSPC的减少与移植后第8周的BM植入无关（图3，G-K）。

图4 人AML细胞在体内产生红细胞分化阻断

Fig.4 Human AML blasts impart an erythroid differentiation blockade in vivo

研究者通过相似的实验进一步探究了植入AML后切脾小鼠中的红系祖细胞变化（图4 A），发现NSGspln--PDX和NSGspln--CB-CD34+小鼠之间的原红细胞数量相似，而NSGspln--PDX小鼠中所有其他红系祖细胞均减少（图4 B-E），并且，红系祖细胞的消耗同样也与AML植入无关（图4 F-I）。这些结果表明，AML母细胞可能通过阻碍原红细胞分化而导致贫血。

图5 人类 AML 通过旁分泌因子抑制正常造血

Fig.5 Human AML suppresses normal hematopoiesis via a paracrine factor(s).

为了检验AML通过旁分泌效应抑制正常造血的可能性，研究者首先在甲基纤维素中进行了小鼠祖细胞集落形成试验（图5 A），该甲基纤维素补充了体外培养的流式纯化的原代AML母细胞(AML-CM)和CB-CD34+细胞(CB-CD34+-CM)。相对于CB-CD34+-CM，在AML-CM存在下，小鼠BFU-E和CFU-GEMM的数量减少（图5 B、C）。对人CB-CD34+细胞进行了类似的实验，发现AML-CM能够抑制人BFU-E（图5 D、E）。

接着，研究者使用共培养系统，进一步研究AML母细胞对红系分化的影响，并使用成熟的标记物CD71和CD235a/GPA评估三周内红细胞分化水平（图5 F），发现AML母细胞的存在降低了红细胞分化培养物中正常母细胞的百分比（图5 G）。

图6 IL-6 由 AML 母细胞差异上调和分泌

Fig.6 IL-6 is differentially up-regulated and secreted by AML blasts.

为了确定可抑制红细胞分化的AML的旁分泌因子，研究者对患者样本的流式纯化母细胞和流式纯化CB-CD34+细胞进行了RNA测序(RNA-seq)，并通过Luminex多重蛋白质测定，鉴定一些主要AML样本的蛋白质，整合几种测定发现IL-6是体外和体内人类原发性AML母细胞中上调的分泌因子（图6 C-F）。

图7 人类AML通过IL-6的旁分泌作用抑制红细胞分化并引起贫血

Fig.7 Human AML suppresses erythroid differentiation and causes anemia via paracrine effects of IL-6.

为了研究IL-6在AML介导的红细胞分化阻断中的作用，研究者在NSGspln--PDX小鼠中使用抗IL-6阻断抗体siltuximab，来研究人类AML分泌的IL-6在BM衰竭中的作用（图7 C）。siltuximab治疗早在治疗后2周就增加了NSGspln--PDX小鼠的血红蛋白浓度（图7 D-G）。在病程后期（d21）开始的siltuximab治疗也改善了血红蛋白浓度和总体生存率，尽管程度较小（图7 H-O）。

总之，本研究推翻了AML的显著的发病率和死亡率是与BM空间过度拥挤有关，并开发了一种脾切除异种移植模型。使用该模型，能够观察到HSPC严重耗竭，特别是红细胞分化受阻，导致进行性贫血；通过蛋白质组学和转录组学研究进一步确定，这种效应是由IL-6的旁分泌介导的；并且，临床批准的抗IL-6阻断抗体siltuximab可以改善AML诱导的贫血并延长总体生存期，这可能是一种潜在的治疗方法。