文献分享：Phase separation-competent FBL promotes early pre-rRNA processing and translation in acute myeloid leukaemia

文献分享：具有相分离能力的FBL促进急性髓系白血病的早期rrna前体的加工和翻译

（23级硕士杨叶欣）

急性髓性白血病（AML）作为成人最常见的急性白血病类型，其生存率仍然不容乐观。近年来，科学家们一直在寻找能够有效打击AML的新靶点和治疗策略。最新的研究发现，调节相分离过程，可能是对抗AML的新途径。相分离（phase separation）是一种细胞内生物分子如蛋白质和核酸通过多价和动态相互作用自发形成独立生物分子凝聚体或无膜隔室的过程。这种生物分子凝聚体在细胞内起着调控基本生命活动的关键作用，其平衡如果被微妙干扰，无论是增加还是减少相分离，都可能导致生理功能异常或紊乱。在急性髓系白血病的发展过程中，RNA结合蛋白（RBPs）及其靶RNA作为相分离凝聚体的常见组成部分，扮演着至关重要的角色。然而，特定具有相分离能力的RBPs在AML中的作用，以及针对相分离干扰的治疗潜力，仍待深入探讨。

2024年5月，良渚实验室/浙江大学基础医学院钱鹏旭及黄河团队在《Nature Cell Biology》杂志上发表了题为Phase separation-competent FBL promotes early pre-rRNA processing and translation in acute myeloid leukaemia的研究论文，探讨了核仁蛋白Fibrillarin（FBL）在急性髓系白血病（AML）中的作用，强调了FBL的相分离特性及其作为潜在治疗靶点的可能性。

图1 体内CRISPR筛选显示FBL是AML白血病发生的必要致癌基因

Fig. 1 In vivo CRISPR screens reveal FBL as an essential oncogene for AML leukaemogenesis.

通过在小鼠体内进行CRISPR筛选（图1a），研究发现在AML进程中，关键的RBPs主要集中在核仁，并将FBL（Fibrillarin）确定为在细胞生存或增殖中起关键作用的基因之一（图1b、c）。对FBL的风险评估结果显示，FBL高表达和AML中常见的突变基因NPM1、FLT3-TKD突变一样，是一个独立的风险因素（图1d）。FBL高表达与较低的生存率有关（图1e），已发表的蛋白质数据库数据结果表明：AML患者中FBL蛋白表达高于正常人CD34⁺HSPC中FBL表达（图1f）。两个数据库中儿童和成人AML病例的FBL mRNA表达均高于正常造血细胞（图1g、h）。定量聚合酶链反应（qPCR）和免疫印迹分析证实，与CD34⁺HSPC相比，AML细胞系中FBL mRNA水平和FBL蛋白水平更高（图1i）。与健康对照组相比，在6例原发性AML患者样本中也观察到FBL丰度的增加（图1j）。综上所述，这些数据表明FBL在AML患者中高表达，并与低生存率相关。

图2 FBL是AML细胞体内外白血病发生所必需的

Fig. 2 FBL is required for in vitro and in vivo leukaemogenesis of AML cells

为了研究FBL在AML中的作用，使用两种短发夹RNA（shRNAs）在原发性AML患者细胞中敲低FBL（图2a）。FBL敲低导致生长缺陷、髓系分化（CD11b⁺）、凋亡增加和集落形成减少（图2b-e）。这些数据表明，高水平的FBL对于AML细胞维持异常增殖、未分化状态和自我更新是必要的。

接下来，本研究在体内评估了FBL对AML进展的影响。建立表达mcherry标记荧光素酶的HL-60，再引入与GFP融合的shFBL，然后将mCherry⁺ GFP⁺ AML细胞移植到NSG免疫缺陷小鼠中。在移植后1周，移植的小鼠注射多西环素以触发FBL敲低。这导致敲低FBL 的AML小鼠白血病进展明显减慢，生存期明显延长（图2f-h）。苏木精和伊红（H&E）染色显示移植后5周，FBL基因下调移植小鼠的骨髓、脾脏和肝脏中的白血病母细胞减少（图2i）。流式细胞术也证实了移植5周后，外周血、骨髓和脾脏中的白血病细胞占比显著降低（图2j，k）。这些结果突出了FBL在AML发展中的关键作用。

图3 FBL的PS结构域对于其在AML中的作用至关重要

Fig. 3 The PS domains of FBL are essential for its role in AML survival and differentiation

接着本研究利用FBL结构域点突变、缺失、替代与嵌合等进行功能筛选（图3a，b），发现FBL的特定相分离属性是其促进AML发展的基础。FBL通过其相分离的互斥型RBD和IDR结构域维持AML的扩增和LSPC的自我更新能力，而不是单纯的甲基转移酶或乙酰化结构域（图3c-e）。

为了阐明GAR和RBD在FBL功能中的重要作用的机制基础，进一步通过超分辨显微技术，研究揭示了FBL蛋白中GAR和MD结构的特定序列对其定位和核仁结构的正确形成至关重要（图3f-j）。

图4 GAR结构域决定、RBD增强FBL凝聚

Fig. 4 The FBL GAR domain dictates condensation, which is enhanced by the RBD

进一步通过体外相分离凝聚体重构实验，揭示了FBL蛋白中GAR结构域驱动了FBL的同型PS，MD结构域与rRNA特异性相互作用促进了FBL的异型PS（图4a-g）。随后，在细胞和体外环境下，进行光漂白后荧光恢复实验（FRAP），与野生型FBL和GAR和MD完整的突变体相比，GAR缺陷突变体表现出更高的流动性，漂白后的荧光恢复速度更快；RBD缺陷突变体（GAR和GAR-Helix）表现出有限的动态性（图4h）。体外FRAP显示FBL凝析物具有凝胶样性质，rRNA的存在增强了FBL在体外的动态变化（图4i、j）。 

这些发现强调了GAR和RBD在FBL相分离理化性质中的重要性。一方面，RBD通过异型相互作用促进rRNA产生区域的蛋白质积累，促进动态液滴的形成。另一方面，GAR驱动蛋白质的自聚集，降低了FBL液滴的流动性。

图5 FBL通过PS增强AML细胞的核仁数量和功能

Fig. 5 FBL enhances nucleolar number and function via PS in AML cells

图6 FBL通过PS促进了AML细胞中致癌基因的翻译

Fig. 6 FBL boosts the translation of oncogenes via PS in AML cells

本研究比较了正常hUCB CD34⁺细胞和AML患者CD34⁺ LSPCs的核仁结构，与AML细胞中FBL表达较高相一致，LSPCs细胞中每个细胞的核仁数量明显较高，与对照组相比，FBL缺失导致AML细胞中核仁较少，在内源性FBL沉默的AML细胞中，IDR缺陷和RBD缺陷突变体的表达也导致核仁减少，揭示了FBL蛋白中GAR和MD结构的特定序列的同型和异型相互作用影响包括LSPC在内的AML细胞的核仁数量（图5a-f）。

结合RiboMeth-Seq（图5g-i）、Northern blot（图5k、l）、RNA-FISH（图5m、n）、RNA-seq、翻译组测序（polysome profiling-seq）等实验发现FBL通过其特定的相分离能力影响一系列pre-rRNA的早期加工活动，如从转录区域的扩散、切割到2’-O-甲基化修饰，这些过程最终改变了包括JAK-STAT信号通路中的关键致癌mRNA的翻译（图6）。 这些功能一方面保证了LSPC的生存和维持，另一方面也确保了AML细胞快速增殖的蛋白质翻译需求。

图7 CGX-635作用于FBL并诱发异常相分离行为

Fig. 7 CGX-635 interaction induces aberrant phase behaviour of FBL

图8 CGX-635对FBL PS的药理干扰可杀伤AML细胞

Fig. 8 Pharmacological perturbation of FBL PS by CGX-635 kills AML cells

此外，研究还发现，药物CGX-635能够直接作用于FBL，改变其相分离行为，有效抑制AML细胞的生长和LSPC的自我更新能力。CGX-635是一种已知的植物生物碱抗癌药物，表面等离子共振技术（SPR）揭示其可与FBL直接结合; 体外相分离实验以及C-Trap荧光光镊系统诱导的液滴融合实验表明CGX-635可能以多价双部位方式介导FBL凝聚物由液态/凝胶态向固态的转变，影响了FBL介导的pre-rRNA的早期处理过程（图7）。与敲低FBL结果类似，CGX-635剂量依赖性地触发AML细胞周期阻滞、分化、凋亡，LSC/LSPC数量和集落形成数量受损；在表达FBL较高的AML细胞中，CGX-635显示出更高的敏感性，这表明CGX-635可能通过靶向核仁蛋白而非组装的核糖体来实现一种新的抗白血病机制（图8）。

本研究首先通过在小鼠体内进行CRISPR筛选，发现在AML进程中，关键的RBPs主要集中在核仁，并确定了FBL（Fibrillarin）作为一个关键核仁蛋白，在促进AML细胞生长、分化阻滞、存活以及维持白血病干/祖细胞（LSPC）自我更新能力方面发挥重要作用。这在很大程度上归因于其相分离属性。该研究描述了FBL在核仁结构和功能中的非典型角色，导致AML白血病发展过程中关键致癌基因的翻译活性增强。同时还展示了药理调控FBL的相分离属性作为一种潜在有效的抗白血病治疗方法。