文献分享：Physiological Jak2V617F Expression Causes a Lethal Myeloproliferative Neoplasm with Differential Effects on Hematopoietic Stem and Progenitor Cells
文献分享：生理性Jak2V617F表达引起致死性骨髓增殖性肿瘤并对造血干细胞和祖细胞有不同的影响
（24级硕士 周鹏展）
作者背景介绍：
Ann Mullally 博士是一名医学科学家，她的研究总体目标是推进对髓系恶性肿瘤的生物学理解，并将其转化为治疗这些慢性血癌患者的改进治疗方案。通讯作者是美国科学院院士Benjamin L. Ebert，Ebert实验室专注于血液系统恶性肿瘤的分子基础和治疗，特别关注骨髓增生异常综合征（MDS）。
研究背景：
JAK2V617F突变是BCR-ABL阴性MPN中最常见的分子异常，大约95%的PV患者和大约50%的原发性血小板增多症(ET)和原发性骨髓纤维化(PMF)患者存在JAK2V617F突变。JAK2V617F在其他髓系恶性肿瘤中存在的频率较低，在淋巴系肿瘤中也没有观察到。JAK2基因的这种获得性点突变导致617位的缬氨酸到苯丙氨酸的替代和JAK2激酶信号传导的组成性激活。
在MPN分子靶向治疗中，JAK2V617F突变将会是一个非常有前景的靶点。
研究思路：
首先，作者建立了一个JAK2V617F敲入小鼠模型，在小鼠胚胎干细胞中通过基因靶向产生了一个Jak2V617F条件敲入等位基因。将所得到的嵌合动物与野生型(WT) C57Bl/6 小鼠杂交，生成 Jak2V617F 杂合小鼠。然后将Floxed 杂合 Jak2V617F 动物与 E2ACre 转基因小鼠杂交，在小鼠早期胚胎发生期间诱导 Jak2V617F 的种系表达。
作者记录了所有小鼠的生存时间与14周红细胞压积（HCT）的变化，比较了脾脏大小。模型小鼠表现出MPN的典型特征，HCT上升，脾脏肿大，骨髓（BM）与脾脏(SP)中CD71+Ter119+红系前体细胞增加。组织病理学显示，组织病理学表明，在Jak2+\-小鼠中有明显的红系和轻度的巨核细胞增生，脾红髓以及正常脾结构的整体消失。与脾脏相比，BM红细胞的增加较轻，但巨核细胞具有不典型的核特征和明显的细胞增多。这些发现表明Jak2+/-敲入小鼠产生一种与人类PV相似的MPN，疾病潜伏期短，生存率降低。
作者发现由于巨核细胞/红细胞祖细胞(MEP)群体的扩增，免疫表型定义的髓系祖细胞(Lineagelow Sca1- cKithigh)在Jak2+/VF小鼠中增加。然后，通过附加标记CD150、CD41和CD105对巨核细胞和红系祖细胞群体进行了更深入的检测。这些研究表明，CD150+ CD41-CD105+ Pre-CFU-E细胞的谱系数量增加。与Jak2+/+小鼠相比，在Jak2+/VF小鼠中，与lineagelowckithighCD150 +CD41-CD105- Pre-Meg细胞lineagelowckithighCD41+ MkP细胞。
由此证明了Jak2V617F导致祖细胞群体明显的红系偏曲，与其他髓系祖细胞相比，MEP细胞不成比例地增加，而Pre-CFU-E细胞相对于巨核细胞祖细胞增加。
为了研究JAK2V617F诱发的MPN的可移植性，作者首先将来自患病Jak2+/VF小鼠的未分离的BM细胞移植到致命或亚致命照射的同窝受体中，并将来自患病Jak2+/VF小鼠的未分离的脾细胞移植到致命照射的同窝受体中。在所有病例中，继发性受体均出现MPN，其特征是在移植后4周HCT升高，该混合移植组的中位生存期为342天。
接下来，作者为了确定包含疾病启动细胞的造血发育阶段。将分别来自Jak2+/VF和Jak2+/+动物BM中高度纯化的LSK、MEP或GMP细胞群移植到致死性辐照的同源继发受体中，并在所有受体中证实供体完全植入。接受Jak2+/VF LSK细胞的受体小鼠产生了与原代小鼠相似的MPN，其特征是HCT升高，白细胞和血小板计数增加，髓外红细胞过度生成，MEP细胞增加。BM中红细胞和巨核细胞增生。相比之下，Jak2+/VF MEP或Jak2+/VF GMP主导的祖细胞群体的受体小鼠在随后的6个月后未发生MPN。此外，在6个月前接受了Jak2+/VF LSK细胞移植的未分离BM小鼠的第三代受体小鼠也发生了HCT升高，并且在死亡后，MPN的组织病理学特征很明显，表明该疾病可连续移植。
作者认为Jak2+/+和Jak2+/VF LSK细胞在细胞周期状态方面没有任何显著差异。实验结果表明，Jak2+/VF和Jak2+/+ LSK细胞之间的JAK-STAT信号转导可能没有差异。作者通过使用流式细胞术利用磷酸化特异性Stat5抗体检测两种LSK细胞内的phospho-Stat5水平。正如预期的那样，细胞因子刺激后，Stat5的激活被JAK2抑制剂TG101348所抑制。这些发现表明，尽管Jak2V617F突变不会扩大LSK细胞数量，但它可以指导LSK细胞的造血分化。
为了确定Jak2V617F等位基因是否赋予Jak2+/VF LSK细胞竞争优势，进行了竞争性移植实验。作者将Jak2+/VF与Jak2+/+按照比例75：25、50：50或25；75将LSK细胞移植到致死性辐照的同源受体中。16周时BM中的LSK细胞嵌合显示，在所有组中，Jak2+/VF与Jak2+/+ LSK细胞的比例从输入Jak2+/VF到Jak2+/+比例略有增加，外周血髓细胞嵌合与LSK嵌合的结果相似。数据表明，Jak2V617F在LSK群体中最多只能提供一种微小的选择性竞争优势。
为了研究Jak2+/VF小鼠对Jak2抑制剂治疗是否有作用，作者用Jak2激酶抑制剂TG101348对原代小鼠进行了给药。给药Jak2+/VF小鼠对治疗的反应具有统计学意义的脾脏大小减小，BM和脾脏细胞增生的组织病理学改善。随后用相同的方法处理了三代受体小鼠，发现小鼠脾脏中红系前体减少。
为了研究Jak2抑制剂对诱发MPN的影响，随后又进行了一系列移植实验。三周后，所有二次受体小鼠的HCT升高，表明MPN诱发群体在初次治疗小鼠中未被消除。为了研究较长时间的治疗是否可以根除疾病诱发群体，用TG101348治疗10周后，将未分离的骨髓从治疗过的二级受体移植到经过致命照射的同源三代受体中，在移植后3周，三代受体仍表现出HCT升高.
这些结果表明，尽管JAK2激酶抑制剂TG101348对连续移植的JAK2V617F诱发的MPN表现出治疗效果，可以减少脾脏大小和红细胞前体细胞数量，但用该药物治疗并不能消除体内MPN启动群体。
总之，该研究报道了Jak2V617F杂合子敲入小鼠模型，该模型产生了类似人类PV的MPN。我们发现LSK细胞室包含MPN启动细胞群，但JAK2V617F对LSK细胞室或其亚群的大小以及细胞周期、信号转导或LSK细胞的基因表达的影响不大。此外，JAK2V617F并没有赋予LSK细胞显著的竞争优势。同时，JAK2激酶抑制剂的治疗剂量并不能根除引发疾病的人群。