文献分享:PPM1D modulates hematopoietic cell fitness and response to DNA damage and is a therapeutic target in myeloid malignancy.
PPM1D 调节造血细胞适应性和对 DNA 损伤的反应，是髓系恶性肿瘤的治疗靶点
（23级硕士 欧阳杰）
作者背景介绍：
本文一作是来自哈佛医学院助理学教授Peter G. Miller，Pete的研究重点是造血细胞生物学、MDS和白血病。本文的通讯作者是Benjamin L. Ebert，2018 年，Benjamin L. Ebert 当选为美国医学科学院院士。Ebert 实验室研究领域包括了解骨髓恶性肿瘤的遗传学和生物学、克隆造血功能的表征，他的研究成果通常发表在高水平的学术期刊上，如《New England Journal of Medicine》《Nature》《Cell》等。
PPM1D 是一种在癌症中经常被激活的丝氨酸 / 苏氨酸磷酸酶，其通过扩增和激活突变等方式在多种肿瘤中发挥作用，尤其在髓系肿瘤中常见。然而，PPM1D 还未在造血和血液系统癌症中进行深入研究，到目前为止已经有几项研究探讨了该基因的功能及突变后变化。它通常在克隆性造血的情况下发生突变（包括淋巴瘤、骨髓增生性肿瘤和骨髓增生异常综合征患者），并且突变与暴露于细胞毒性和放射治疗、治疗相关肿瘤的发展和生存率较低有关，对于其肿瘤细胞生长中的功能及其对肿瘤细胞治疗反应的影响尚未完全明确。
PPM1D 由P53蛋白激活转录，但它负向调节 DNA 损伤反应通路内的信号分子，包括P53、ATM、mTOR、P38等。通过研发PPM1D抑制剂，可能阻止 PPM1D 突变激活所造成的造血细胞的异常存活，促进细胞凋亡。
作者通过构建Ppm1dT476*-fl/+ 截断突变小鼠模型，检测了10个月PB和BM中WBC、Lymphocytes、Plt、Hct，以及干细胞数量百分比变化，发现Ppm1dT476*-fl/+比Ppm1d+/+无显著差异。之后又构建竞争性小鼠实验，探究Ppm1d突变后的异常激活对造血干细胞的影响，发现Ppm1d异常激活增强造血干细胞的竞争性，并且在Cisplatin、XRT的胁迫下，与WT对比显示出更强的竞争性。在多轮移植实验中，WT组的造血干细胞完全丧失造血重建能力，相比之下，Ppm1dT476*-fl/+组小鼠仍然表现出很高的嵌合率。说明Ppm1d 突变增强造血细胞的竞争适应性。
通过构建条件性Ppm1dfl/fl敲除小鼠模型，同样监测10个月PB和BM细胞变化，发现Ppm1dfl/f与Ppm1d+/+在WBC、Lymphocytes、Plt、Hct，以及干细胞数量百分比无显著差异。通过构建竞争性小鼠模型发现 Ppm1d 缺失导致造血细胞在竞争中处于劣势，特别在化疗放疗胁迫条件下表现更明显。在连续移植中无法实现完全嵌合，且对亚致死照射更为敏感。进一步研究表明，Ppm1d 缺失导致的 HSC 竞争适应性受损依赖于p53。说明Ppm1d 缺失损害造血细胞的竞争适应性和连续移植能力，这也为后来的抑制剂开发提供思路。
通过构建Trp53R172H/+突变小鼠模型，与Ppm1dT476*/+小鼠进行竞争性移植实验，比较 Ppm1d 和 Trp53 突变对 HSC 适应性的影响，发现TP53突变的细胞在暴露于顺铂或辐射后比 Ppm1d 截断突变的细胞更具竞争优势，但Trp53R172H 细胞并未完全淘汰Ppm1dT476*/+ 细胞。这表明 Ppm1d 激活虽能抑制 DDR，但程度较p53失活弱。说明TP53 缺失比 PPM1D 激活在基因毒性暴露后赋予更显著的选择优势。
在原代白血病细胞实验中，Ppm1d突变激活的白血病细胞对细胞毒性疗法有抗性，而 Ppm1d条敲缺失的白血病细胞对包括柔红霉素、阿糖胞苷、地西他滨和阿扎胞苷等在内的药物很敏感。在白血病细胞中，加入PPM1D 抑制剂 GSK2830371且这些药物协同作用，发现能显著增强对白血病细胞的杀伤效果，并且在体内实验中也得到了验证。说明Ppm1d 缺失或对Ppm1d药物抑制，使原代白血病细胞对临床使用的细胞毒性药物更敏感。
通过分析基因表达和全基因组 CRISPR/Cas9 筛选数据，发现 TP53 缺失是对 PPM1D 抑制产生抗性的最强机制。在大规模细胞系活力筛选中，PPM1D 抑制能增强多种组织类型细胞对细胞毒性药物的敏感性，尤其在 TP53 野生型细胞中效果更明显。作者还设计了Ewing sarcoma (EWS) lines（尤文肉瘤）、neuroblastoma (NB)（神经母细胞瘤）细胞系中的TP53 WT组和TP53 突变失活组的联合用药实验，说明PPM1D 抑制剂 GSK2830371在TP53 WT的细胞系中对肿瘤抑制效果更明显，也提示在P53 WT的肿瘤患者中，加入GSK联合用药可能获得更好的的治疗效果。
这篇文章，Peter G. Miller团队开发了 Ppm1d 截断突变和缺失的条件性小鼠模型，发现 Ppm1d 突变增加HSC在正常和有DNA损伤应激下的适应性，并增强了 HSC 连续移植的能力；同时，探究原代白血病细胞在 Ppm1d缺失或抑制条件下临床治疗的细胞毒性作用，发现Ppm1d 的基因缺失或药物抑制条件下，小鼠和人类白血病细胞在体外和体内对柔红霉素、阿糖胞苷、地西他滨和阿扎胞苷等这些药物更敏感。在成年小鼠中急性 Ppm1d 缺失表现出良好的耐受性，几乎没有观察到毒性。这些数据支持 PPM1D 药物抑制，特别是与放疗或化疗联合使用，可以作为一种治疗策略。Ppm1d 激活突变增强了 HSC 的竞争适应性和连续移植能力，这与人类遗传数据一致，即造血细胞中克隆性、体细胞 PPM1D 激活突变在无先前细胞毒性暴露史的患者中也常被观察到。在HSC中，TP53突变比截断Ppm1d 激活突变在暴露于细胞毒性治疗后赋予细胞更强的适应性优势，表明 p53 的缺失可能是 DDR 更有效的抑制剂。CRISPR/Cas9 抗性筛选表明 PPM1D 抑制需要 p53 来影响细胞增殖，分析癌症依赖图谱证实了 PPM1D 敲除的增殖效应依赖于细胞 TP53 突变状态。在尤文肉瘤和神经母细胞瘤细胞中的实验结果也表明，PPM1D 抑制可使 TP53 野生型细胞对基因毒性应激更敏感，TP53 突变可能成为对这种治疗方法产生抗性。
综上所述，该研究揭示了 PPM1D 在正常和恶性造血中的重要作用，阐明了人类群体中的遗传观察结果，并为将 PPM1D 作为许多肿瘤治疗靶点提供了框架和基础。