PBJ | 西北农林科技大学房玉林课题组解析葡萄冬芽休眠解除过程中的内源信号转导网络

原创 PBJ 植物生物技术Pbj

2025年03月19日 01:00

近日，Plant Biotechnology Journal杂志在线发表了由西北农林科技大学房玉林课题组撰写的“Multi-omics analysis of the regulatory network in winter buds of ‘Cabernet Sauvignon’ grapevine from dormancy to bud break”论文。该研究分别收集田间与室内从休眠到萌发的‘赤霞珠’冬芽，对这些样本进行转录组、蛋白质组和植物激素含量的分析。研究发现无论是室内还是室外，冬芽均表现为休眠、休眠释放和芽发育三个主要阶段。利用加权相关网络分析（WGCNA）和基因本体分析（GO）对组学数据进行了分析，发现不同阶段响应的生物过程不同。差异表达基因（DEGs）分析鉴定出7个可能影响葡萄休眠和萌发的候选基因。对这7个基因进行瞬时转化冬芽实验，发现VvDOGL4、VvAGL65和VvMARD能够促进葡萄冬芽休眠的维持。亚细胞定位表明，这三种蛋白均位于细胞核内，酵母双杂交筛库发现，它们可能与植物激素信号转导、呼吸、能量代谢和转录调节等相关蛋白相互作用，进而影响葡萄冬芽的萌发。总之，这些发现有助于更好地理解多年生水果作物芽休眠的调控动态，并为探索芽休眠关键基因和调控机制奠定基础。

为适应冬季的严寒与水分胁迫，在寒带和温带的多年生木本植物需要在冬季进行休眠。休眠建立后，需要长时间的低温以满足植物的需冷量才能在合适的条件下重新恢复生长。在葡萄等植物中，芽的休眠被分为三类，类休眠（Paradormancy，PD）、内休眠（Endodormancy，ED）和生态休眠（Ecodormancy，ECD）。葡萄具有较明显的生长期和休眠期，如果葡萄的需冷量没有满足，即使环境条件适宜，也难以萌芽展叶，或者造成萌芽不整齐，生长结果不良，严重影响葡萄的产量和品质。葡萄冬芽的休眠与萌发涉及多种调控网络，包括植物光感应器，细胞周期基因，氧化应激反应，碳水化合物代谢以及植物激素等（Beauvieux, Wenden, and Dirlewanger, 2018; Kuehn et al., 2009; Vergara et al., 2017）。内休眠状态的芽对环境信号刺激不敏感，条件有利亦不萌发，除非出现打破休眠信号。高温、低温、缺氧等物理或单氰胺、石灰氮、植物激素等化学处理方法和刺激均可改变休眠芽生理状态，此时涉及氧化应激与抗氧化，糖酵解、丙酮酸代谢、厌氧呼吸相关，碳水化合物代谢、植物激素等多种代谢通路（Sudawan et al., 2016; Vergara, Rubio, and Perez, 2012; Zheng et al., 2018a, b）。尽管人们对葡萄芽休眠进行了广泛的研究，但我们对相关分子网络的了解仍然有限。西北农林科技大学房玉林课题组利用多组学探究‘赤霞珠’葡萄冬芽从冬季休眠到萌芽的调控网络，旨在使用这些数据来说明调控葡萄冬芽萌发的主要代谢途径随时间的变化，探索葡萄冬芽休眠与萌发形成机理。全文主要研究结果如下：

1. 从休眠到萌芽葡萄冬芽内部变化

使用体视镜观察冬芽的发育情况（图1），发现田间的样本在伤流期前，冬芽外部及内部未见明显变化。伤流期时，冬芽内部主芽明显膨大，花原基序开始发育。萌芽期采集了鳞片稍稍开裂（BS）、绒球期（BD）以及萌芽（BB）三种状态下的冬芽，可以观察到BS时冬芽外部芽明显膨大，鳞片开裂，芽轴开始逐渐伸长；BD时外表可见鳞片被顶破，芽呈绒球状，主芽内部芽轴进一步伸长；已萌芽的冬芽内部已清晰可见未来新梢结构。室内收集到的冬芽发育过程与田间基本一致，在10d时开始有冬芽萌发（图1C）。

图1 葡萄冬芽发育剖面图

2. 葡萄冬芽从休眠到萌发经历三个阶段的变化

收集2020-2021年从内休眠到萌芽的田间生长的‘赤霞珠’冬芽，伤流期后采样次数增加，一共12组样本用于转录组测序。同时收集室内扦插的从休眠到自然萌芽的葡萄冬芽的转录组样本，每隔两天收集一次，共收集9组。结合PCA（图1e，g）、Pearson相关性（图1f，h）和表型变化（图1c，d）的结果，发现田间和室内样品从休眠到萌芽的转录组均表现出的三个发育阶段：休眠期、休眠释放期和芽发育期。三个阶段的时间划分为，田间：100d before BB- 80d before BB，50d before BB -19d before BB，以及 bleeding period -BB。室内分别为0-2 d、4-10 d和12-14 d。

3. 利用WGCNA和GO富集分析探究各休眠阶段活跃的生物过程

对田间和室内的转录组进行WGCNA分析，以便观察各基因随时间发育的变化趋势。田间转录组数据经WGCNA分析过滤后剩余18815个DEGs，分属于7个模块；室内转录组WGCNA分析过滤后剩余19341个DEGs，包含9个模块，各模块随着时间呈现规律性的变化趋势，且变化的拐点基本与前文三个发育阶段一致（图2）。

图2. 在转录水平上对休眠各阶段变化过程进行GO富集分析

根据WGCNA的分析，重点观察田间转录组中red、turquoise与blue这三个模块，依据其变化趋势，推测三者分别包含大量促进萌芽、促进芽发育以及促进芽休眠的关键基因，同时对这三个模块进行GO注释（图2）。同样，在室内中重点关注pink、turquoise和brown模块。

GO富集分析后发现，在葡萄冬芽休眠阶段，大量的细胞代谢、合成和信号转导过程受到负调控，而与光信号、植物激素信号和非生物刺激相关的转录本的富集提高了冬芽耐寒的能力。在休眠释放期，RNA剪接调节、脱落酸信号通路、激素合成代谢、酒精反应等途径更加活跃。芽萌发前，许多细胞壁相关通路、各种器官和组织的形成、激素信号和各种植物向性都处于活跃状态。萌发后，与有丝分裂和细胞周期相关的基因起主要作用，表明细胞通过分裂开始快速生长。

4. 芽休眠不同阶段调控途径的蛋白质组学变化

从田间试验中选取80 d before BB，28 d before BB，14 d before BB（bleeding stage），BS，BD和BB6组样本，从室内试验中选取0 d，4 d，8 d，12 d和14 d的5组样本进行蛋白质组学分析（图3）。WGCNA分析后发现室内可分为9个模块，但有规律性变化的模块仅有三个；田间差异蛋白被分为三个模块。对田间室内共6个重点模块进行GO富集分析，发现蛋白组的WGCNA分析后划分的模块更少，规律性也更少，但也有一致的部分。两个组学的模块分析表明在休眠期，伤流期前，树体各类氧化应激，过氧化氢酶体相关以及蛋白质运输、定位相关的通路比较活跃。在冬芽萌发前，各类小分子分解代谢以及形态建成相关通路被启动，直到开始萌芽后氨基酸、蛋白质、维生素等合成相关通路被大量激活，来满足植物的生长发育需求。

图3. 葡萄冬芽从休眠到萌芽的蛋白质组学

5. 冬芽发育过程中植物激素的变化

植物激素在芽发育的过程中至关重要，利用LC-MS/MS平台定量检测田间6组，室内5组冬芽样本的8大类植物激素的含量，包括：生长素、细胞分裂素、脱落酸、茉莉酸、水杨酸、赤霉素、乙烯类和独脚金内酯（图 4）。但在实际检测中未检测到SLs的存在。并通过KEGG富集分析，使用热图展示了样本中植物激素信号转导相关基因表达量的变化。这些变化在冬芽从休眠到破芽再到生长的过程中普遍遵循一定的模式，表明这些植物激素之间存在复杂的串扰作用，协同影响植物的生长发育。

图4. 植物激素含量与其信号转导途径基因表达量变化

6. 影响休眠和萌芽的关键基因筛选

为寻找影响葡萄冬芽休眠/萌发的关键基因，研究者选择田间和室内转录组内共有的基因，分析其FPKM值变化趋势、log₂FC值及功能注释，筛选到7个可能影响芽萌发/休眠的候选基因。候选基因瞬时转化实验发现，VvGAST1可能对芽休眠没有明显作用，而VvERF114、VvMARD、VvDOGL4、VvEA1、VvAGL65和VvEB1可能抑制芽萌发，促进芽休眠（图5 a-d）。

图5. 候选基因功能验证

进一步研究瞬时转化实验中表型更为明显的三个基因VvAGL65、VvDOGL4和VvMARD，亚细胞定位发现三者均定位于细胞核中（图5 e）。通过酵母双杂交系统筛选与这三种蛋白相互作用的蛋白，发现VvMARD可能与生长素、赤霉素、脱落酸信号相关蛋白，细胞壁扩张蛋白以及多种转录因子存在相互作用。VvAGL65可能的相互作用蛋白包括与油菜素类固醇、生长素、乙烯、茉莉酸等植物激素信号通路相关的蛋白，以及germin-like蛋白、脂质代谢相关蛋白、热休克蛋白和微管蛋白。VvDOGL可能结合更多参与呼吸、碳水化合物代谢和各种运输的蛋白质，以及脱落酸合成，过氧化物酶，脱落酸、生长激素和乙烯信号通路的蛋白质。

本研究从转录和蛋白水平将葡萄冬芽从休眠到萌发的过程划分为三个主要阶段：休眠、休眠释放和芽发育，并发现不同阶段响应的生物过程存在很大差异（图6 a）。研究还筛选出可能影响葡萄冬芽休眠或萌发的关键基因（图6 b），为通过现代分子育种技术调控葡萄冬芽的萌发提供了基因资源。

图6. 葡萄冬芽从休眠到发芽的调控网络多组学分析

该课题在分子水平上系统研究了葡萄冬芽从休眠到萌发过程中转录、蛋白及激素水平上主要代谢过程的变化，构建了葡萄冬芽休眠解除过程中的内源信号转导网络，为更好的揭示葡萄冬芽休眠与萌发的分子调控机制奠定了理论基础，也为在葡萄产期调节、副梢控制等实际应用环节中实现葡萄芽萌发的精准调控提供了理论支撑，具有重要的科学和应用价值。

西北农林科技大学葡萄酒学院房玉林教授与张克坤副教授为该研究工作的共同通讯作者，博士生陈莉为论文第一作者，课题组陈可钦副教授、硕士生姜家鹏和王丹也参与了该研究。研究工作得到了国家自然科学基金，山东省重大科技创新工程项目等项目的资助。

论文链接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/pbi.70014

References:

Beauvieux R, Wenden B and Dirlewanger E (2018) Bud dormancy in perennial fruit tree species: a pivotal role for oxidative cues. FRONT PLANT SCI 9.

Kuehn N, Ormeno-Nunez J, Jaque-Zamora G and Perez FJ (2009) Photoperiod modifies the diurnal expression profile of VvPHYA and VvPHYB transcripts in field-grown grapevine leaves. J PLANT PHYSIOL 166:1172-1180.

Sudawan B, Chang C, Chao H, Ku MSB and Yen Y (2016) Hydrogen cyanamide breaks grapevine bud dormancy in the summer through transient activation of gene expression and accumulation of reactive oxygen and nitrogen species. BMC PLANT BIOL 16.

Vergara R, Noriega X, Aravena K, Prieto H and Perez FJ (2017) ABA represses the expression of cell cycle genes and may modulate the development of endodormancy in grapevine buds. FRONT PLANT SCI 8.

Vergara R, Rubio S and Perez FJ (2012) Hypoxia and hydrogen cyanamide induce bud-break and up-regulate hypoxic responsive genes (HRG) and VvFT in grapevine-buds. PLANT MOL BIOL 79:171-178.

Zheng C, Acheampong AK, Shi Z, Halaly T, Kamiya Y, Ophir R, Galbraith DW and Or E (2018a) Distinct gibberellin functions during and after grapevine bud dormancy release. J EXP BOT 69:1635-1648.

Zheng C, Acheampong AK, Shi Z, Mugzech A, Halaly-Basha T, Shaya F, Sun Y, Colova V, Mosquna A, Ophir R, Galbraith DW and Or E (2018b) Abscisic acid catabolism enhances dormancy release of grapevine buds. PLANT CELL ENVIRON 41:2490-2503.

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