JACS：利用生物合成引导和酶催化定制定向挖掘真菌DMOA来源的杂萜类分子

DMOA来源的杂萜类分子在真菌中广泛存在，具有复杂多样的结构和广泛的生物学活性。几十年来，在基于DMOA来源的杂萜类分子生物合成的深入研究中发现，后修饰酶包括Fe(II)/α-KG依赖的加氧酶（α-KG/D）和P450氧化酶在其结构多样性方面发挥着至关重要的作用。在DMOA来源的杂萜类化合物中存在一类亚型结构dhilirane型杂萜（DMs），其拥有6/6/6/5/5环系的核心骨架，这种独特的环系结构使其成为真菌萜类化合物中一个罕见的类别。该化合物最初从Penicillium purpurogenum中分离得到，对卷心菜害虫的摄食具有抑制作用。迄今为止，仅鉴定出11个同系物，其化学多样性在很大程度上仍未被探索。值得注意的是，该类结构B/C环的非立体选择性桥头碳原子使其形成不同的多环体系，极大的拓展了该类结构的多样性，目前关于dhilirane型杂萜结构的生合机制仍不清楚。

近日，来自北京大学药学院的研究团队基于对其生物合成的理解，开发了一种通过基因组挖掘、代谢产物分析和后修饰酶催化来发现DMs的工作流程。据此鉴定了23种新的DMs，其中包括7种新骨架结构。研究发现，Fe(II)/α-酮戊二酸（α-KG）依赖型加氧酶DhiD能够催化dhilirolide D的非立体选择性环收缩，形成dhilirane骨架；而细胞色素P450酶DhiH则通过构建多种C-C键和氧化反应，重塑了DMs的结构多样性。晶体学和突变实验为DhiD的反应及其立体异构产物的形成提供了分子基础。并且，DhiD在DMs化学扩展中表现出底物控制的催化多功能性，通过缩环、羟化、脱氢、环氧化、异构化、差向异构化和α-酮醇裂解等反应发挥作用。生物活性实验结果表明DMs具有抗炎和杀虫活性。工作揭示了自然界中DM生物合成的有力工具以及Fe(II)/α-KG依赖加氧酶和P450酶的功能多样性，这些发现可用于DM型天然产物的靶点发现和多样化研究。

图1. 通过基因组挖掘和代谢组分析发现新DMs

本文首先利用核心基因PKS、PT、TC对实验室的基因组数据库进行深入挖掘，成功定位到一株含有杂萜生物合成基因簇的南极真菌Penicillium purpurogenum AN13。通过生物信息学分析，发现该菌株特有的后修饰酶DhiD和DhiH，这可能预示着它具备产生新颖杂萜分子的巨大潜力。接着，对该菌株的发酵产物进行了代谢组分析，利用NMR和LC-MS分析，进一步证实了该菌株能够产生新的DMs。最终，我们从该菌株的代谢物中成功分离并鉴定了7个新的DMs（2-8），其中包括两个新骨架结构（图1）。

图2. 通过A. nidulans的异源表达以及喂养实验验证DhiD和DhiH的体内催化功能

为验证DhiD和DhiH在DMs生物合成中的功能，本文在将两个后修饰酶基因在Aspergillus nidulans 中进行异源表达，并以dhilirolide D (1)、dhilirolide J (13)、dhilirolide B (10)、dhilirolide L (14)为底物进行生物转化实验。结果表明DhiD催化dhilirolide D (1) 的B环缩合，形成dhilirane核心骨架，P450氧化酶DhiH则通过催化不同的C-C键形成和氧化反应，进一步重塑了下游结构的多样性（图2）。

图3. DhiD功能的体外表征

体外酶催化实验进一步证实DhiD以Fe(II)和α-KG为辅因子，将dhilirolide D (1)转化成13、14和17。当13作为底物时，DhiD可进一步将其转化为17、18和19。这些结果表明，DhiD是一个多功能的α-KG/D，不仅可以催化B环缩合，而且可以对产物进行进一步的修饰（图3）。

图4. DhiD的催化机制解析

为了探究DhiD催化的非立体选择性的缩环反应机理，本文解析了DhiD的晶体结构（2.58 Å），发现DhiD存在一个大的开放口袋，其活性中心含有一个由2-His-1-Asp组成的facial triad。DhiD与底物1的分子对接模型显示1的C-13位点距Fe中心的距离为4.1Å，表明DhiD可能攫取C-13的桥头氢原子启动反应，接着将与底物相互作用的8个氨基酸突变为丙氨酸，其中，突变体Q129A显著降低了反应活性，在H116A和V137A几乎观察不到化合物14的产生，但对13、17和18的产量影响较小。分子对接模型表明，H116可以稳定B环缩合的关键中间体I-3。由此，本文提出了一种DhiD催化缩环反应的可能机理：首先，Fe(IV)-oxo攫取底物1的C-13位氢原子，生成自由基中间体I-1/I-1'，随后经分子内电子转移和半频哪醇重排，生成在C-13位的差向异构中间体I-2和I-3。中间体I-3的C-14羰基与OH-9较近的距离使其分子内自发连续的亲核加成生成化合物13，而中间体I-2则经Oxa-Michael加成生成14（图4）。

图5. DhiD催化8、10和12生成新DMs

α-KG/D具备催化多种新颖反应的能力。为了发掘潜在的新反应类型及DM同系物，本文对分离得到的化合物进行了DhiD底物杂范性的评估。有趣的是，DhiD可接收8、10和12为底物，生成13个新的DMs，包括5个新骨架结构，极大的拓展了该类结构的化学多样性。其中涉及的反应类型包括羟化、脱氢、环氧化、异构化、差向异构化和α-酮醇裂解等反应。这些新颖骨架结构通过DhiD催化的自由基偶联，不同的断键模式及不同位置的氧化生成，进一步说明了DhiD作为生物催化剂的潜力（图5）。最后，本文发现部分DMs表现出良好的杀虫和抗炎活性。

综上所述，本文通过生物合成引导和后修饰酶催化的策略，成功发现了23种新DMs，其中包含7个新骨架结构。在这一过程中，鉴定出多功能Fe(II)/α-KG依赖的加氧酶DhiD和P450酶DhiH分别扮演着构建核心dhilirane骨架和催化多样化反应以丰富结构多样性的关键角色。基于结构的定点突变分析进一步揭示，DhiD可能通过半频哪醇重排机制催化环收缩，从而生成立体异构产物，并确定了H116和V137两个氨基酸残基对于C-13位α方向产物的立体选择性具有决定性作用。此外，DhiD展现出广泛的催化能力，能够催化多种杂萜化合物发生包括缩环、羟化、脱氢、环氧化、异构化、差向异构化及α-酮醇裂解在内的多种反应，并得到16个新的DMs。这一发现极大地丰富了DhiD可催化的产物类别，显著拓宽了其产物骨架的多样性。与此同时，DhiH不仅催化dhilirolide B的环氧化反应生成dhilirolide A，还构建了不同C-C键的形成，从而生成了具有新颖骨架结构的dhilirolides O和P。同时，部分dhilirolides展现出了抗炎和杀虫活性。这些研究成果不仅揭示了自然界构建复杂DMs的高效策略，而且表明这两种多功能氧化酶DhiD和DhiH在真菌萜类化合物的靶向发现及化学扩展中可能扮演着重要生物催化剂的角色。此外，本文工作也凸显了生物合成引导和酶催化定制策略在天然产物发现领域的重要性和巨大潜力。随着真菌基因组资源的日益丰富和已解析生物合成途径的不断增加，这一方法将极大地推动对更广泛化学空间的探索，为发现目标天然产物提供强有力的支持。

该研究成果近日发表在Journal of the American Chemical Society 上，北京大学药学院博士研究生孙照伦、吴梦月为共同第一作者，北京大学药学院林文翰教授、范爱丽副教授为该论文共同通讯作者。

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Target Discovery of Dhilirane-Type Meroterpenoids by Biosynthesis Guidance and Tailoring Enzyme Catalysis

Zhaolun Sun, Mengyue Wu, Boyuan Zhong, Jingshuai Wu, Dong Liu, Jinwei Ren, Shilong Fan, Wenhan Lin*, Aili Fan*

J. Am. Chem. Soc., 2024, DOI: 10.1021/jacs.4c09298