铜绿假单胞菌是一种机会性革兰氏阴性菌，是免疫功能受损人群医院感染的主要原因之一，尤其是伤口感染、呼吸机相关肺炎（VAP）和囊性纤维化（CF）患者。在多药耐药ESKAPE病原体中，由于其对不断变化的环境的高度适应性，铜绿假单胞菌对多种抗生素的耐药性日益增强，已被世界卫生组织列为三大关键优先病原体之一。围绕耐药菌感染的预防和治疗策略，开发针对铜绿假单胞菌的新型抗生素极其困难，接种疫苗可以作为预防铜绿假单胞菌感染的一种有前途的替代策略。鉴于抗原的多样性、天然聚糖的微观非均一性以及在从培养细菌中分离抗原时可能存在内毒素的潜在污染等原因，目前还没有针对铜绿假单胞菌的疫苗获得上市许可。胞外多糖褐藻胶是铜绿假单胞菌表面的高度保守抗原，具有针对几乎所有铜绿假单胞菌菌株提供广泛保护的潜力。

1、利用高度保守的合成抗原，设计和制备了一种基于甘露糖醛酸四糖的铜绿假单胞菌广谱糖疫苗。

2、该糖疫苗可引发强烈而特异性的免疫反应，所产生的抗体不仅能够识别不同类型的铜绿假单胞菌菌株，而且能够根据菌株表面表达的褐藻胶的量以不同的水平介导对细菌的调理吞噬杀伤作用。

3、接种该糖疫苗有效促进了粘液型菌株PAC1在小鼠肺部和血液中的清除，降低了促炎细胞因子的释放，显著提升了感染非粘液型菌株PAO1的小鼠生存率。

图1. ELISA检测CRM197-1缀合物疫苗免疫小鼠后血清中的抗体滴度

首先将甘露糖醛酸四糖1和CRM197制备成糖缀合物疫苗。用CRM197-1缀合物疫苗皮下注射免疫雌性 C57BL/6J小鼠，并获得小鼠血清（图 1A）。通过ELISA法检测免疫后小鼠血清中的抗体滴度，从而评价CRM197-1的免疫活性。结果显示，与对照组相比，第35天CRM197-1加弗氏佐剂免疫后血清产生了非常强烈的IgG抗体（图1B-C）以及稍弱的IgM抗体（图1D）。进一步分析血清中 IgG抗体的亚型，发现IgG1 和 IgG2b 抗体在特异性 IgG 抗体中占比最高（图1E-H）。

图2. 检测CRM197-1免疫后小鼠血清对铜绿假单胞菌的结合情况和调理吞噬杀菌活性

进一步检测 CRM197-1缀合物加弗氏佐剂免疫后的血清与铜绿假单胞菌菌株识别与结合的情况。此处选择的三种铜绿假单胞菌菌株分别是标准菌株CICC10419、PAO1和临床分离菌株PAC1。与小鼠免疫前血清相比，第35天的免疫后血清与PAC1 有很强的结合力，与CICC10419 和PAO1有较明显的结合（图2A-C）。这可能是由于三种铜绿假单胞菌表达的藻酸盐含量不同所造成的。

为了评价CRM197-1缀合物疫苗的保护作用，进行了体外调理吞噬杀菌试验（OPKA）。实验结果表明，CRM197-1免疫小鼠后产生的抗体促进了补体介导的针对铜绿假单胞菌CICC 10419和非粘液型PAO1的吞噬作用（图2D-G）。抗 CRM197-1 抗体对粘液型菌株 PAC1 有更强的吞噬活性（图 2H-I）。对照组血清则没有观察到杀菌活性。总体而言，含抗CRM197-1抗体的血清对粘液型菌株PAC1 的杀菌活性更强，可能是由于该粘液菌株表面的藻酸盐过度表达所致。

图3. 评估CRM197-1缀合物疫苗在体内水平的保护作用

按照此文中的免疫程序对小鼠进行免疫，并在免疫结束一周后气管内灌注感染 5×10⁶ CFU的PAC1 菌液。感染48小时后，取小鼠肺部匀浆和血液进行涂布。与接种PBS或弗氏佐剂的对照组相比，接种 CRM197-1 和弗氏佐剂可显著降低小鼠肺部和血液中PAC1 的细菌载量，表明CRM197-1的主动免疫引起了保护性免疫反应，导致肺部和血液中针对粘液菌株的清除率提高。为了确定接种CRM197-1疫苗是否能缓解PAC1感染过程中细胞因子的释放，对血清中的促炎细胞因子IL-1β和IL-6进行了测定，发现CRM197-1缀合物疫苗可显著降低促炎细胞因子的释放。

进一步评估了CRM197-1对非粘液型铜绿假单胞菌PAO1造成的小鼠急性肺部感染是否有保护作用。免疫小鼠后，在第一次免疫后第35天通过气管插管滴注的方法用铜绿假单胞菌PAO1（2.3×10⁷ CFU）感染小鼠。之后，每12h观察小鼠的生存情况，持续监测7天（图3B）。结果显示，接种CRM197-1/佐剂组的小鼠生存率为83.3%，而PBS组存活率则为16.7%。这些数据表明，与PBS组相比，CRM197-1与佐剂混合免疫小鼠能显著提高了小鼠的存活率（P＜0.05）。

总之，我们开发了一种基于甘露糖醛酸四糖的铜绿假单胞菌广谱糖缀合物疫苗。该糖缀合物疫苗结构均一，免疫小鼠能引起强烈而特异性的免疫反应，其所产生的抗体能够识别不同类型的铜绿假单胞菌，并能够根据菌株表面表达的褐藻胶的量以不同的水平介导对铜绿假单胞菌的调理吞噬杀伤作用。该糖缀合物疫苗对粘液型和非粘液型铜绿假单胞菌菌株的感染具有广泛的保护作用，有潜力被开发成针对几乎所有铜绿假单胞菌的广谱糖疫苗。

杨友，华东理工大学教授，国家海外高层次青年人才，山东省泰山产业创新领军人才，上海市浦江人才。主要从事糖化学、糖药物和糖材料的研究。在ACS Cent. Sci., Angew. Chem. Int. Ed., J. Am. Chem. Soc.等期刊发表论文50余篇。担任中国化学会糖化学专业委员会委员，中国生化制药工业协会糖类药物分会专家委员会委员，中国疫苗行业协会糖疫苗专业委员会委员，Curr. Opin. Chem. Biol.客座编辑，J. Carbohydr. Chem.编委。获得中国药学会-施维雅青年药物化学奖、华东理工大学青年英才校长奖等奖励。

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