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南京师范大学黄和/张幸&南京大学袁帅Nano Letters：DNA介导的MOF-纤维素膜定向自组装微生物反应器的构建及其应用
发布时间：2024-03-19

近日，南京师范大学食品与制药工程学院张幸教授、南京大学化学化工学院袁帅教授在国际知名期刊《Nano Letters》上合作发表题为《DNA-Directed Assembly of Hierarchical MOF-Cellulose Nanofiber Microbioreactors with “Branch-Fruit” Structures》的研究论文。本研究在室温、水环境中合成了一种新型，高稳定性的Ni-MOF，实现了酶的原位包封。基于该MOF平台，作者开发了一种DNA定向自组装策略，将MOF纳米颗粒均匀地放置在细菌纤维素纳米纤维上，从而形成独特的“枝果”状结构。由此产生的杂化材料在各种催化系统中表现出显著的多功能性，可容纳天然酶、纳米酶和多酶级联等反应体系，展示出作为通用型微生物反应器的巨大潜力。此外，层次化复合材料促进了大块底物的快速扩散，同时保持了酶的稳定性，与传统的固定在细菌纤维素纳米纤维中的酶@MOF相比，其相对活性提高了2.6~3.5倍。

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图1 酶@Ni(ICA)2-BC的合成示意图

金属有机框架（MOF）因其孔径可调节、稳定性强、生物相容性高等特点，成为了酶固定化的理想材料。然而，大多数MOF苛刻的合成条件，阻碍了酶的原位包封，许多MOF在水中的不稳定性限制了它们在水缓冲溶液中酶的催化作用。目前，只有少数基于Zn、Co的MOF（包括ZIFs和MAF-7）被用于生物大分子的原位包封。同时，酶@MOF颗粒由于缺乏多级多孔结构，酶@MOF颗粒分离回收步骤繁琐，离心过程会破坏酶和MOF的结构等原因，不利于酶催化反应的进行。

在这项研究中，作者开发了一种由Ni2+和2-甲醛咪唑（ICA）形成的水稳定型MOF，记为Ni(ICA)2。其中，ICA具备亲水性醛基和疏水性咪唑基团，是一种具备兼性疏水/亲水性的有机配体，有助于酶的固定化和活性开展，Ni2+可以与His标签标记的酶发生特异性结合，能够进一步提高酶的固定效率，与具有d10轨道的Zn2+相比，Ni2+具有部分填充d轨道，在与配体配位时具有更高的晶体场分裂参数和更大的晶体场稳定能量，能保证MOF的稳定性，酶活性口袋能够选择性地识别和结合过渡金属（如Ni，Pd），提高酶的选择性和活性，Ni能够与DNA形成Ni-O-P键，发生牢固地连接，为自组装体系奠定基础。软件分析及表征测试结果表明，Ni(ICA)2呈少见的qtz拓扑结构。作者以脂肪酶（CRL）为模型，通过共沉淀的方式合成了CRL@Ni(ICA)2，实现了酶的原位包封，并阐明了酶与Ni(ICA)2的相互作用机制。

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图2 酶与Ni(ICA)2的相互作用

作者以DNA为桥梁，利用Ni2+能够与DNA稳定结合，形成牢固的Ni-O-P键这一原理，将Ni(ICA)2均匀地富集在细菌纤维素膜（BC）上，形成了“果枝”状酶@Ni(ICA)2-BC自组装体系，以酶@Ni(ICA)2为微催化单元，以细菌纤维素膜（BC）网络为宏观支撑，这种分层结构确保了生物大分子的稳定封装，促进了大体积反应物和产物的有效传质。并且可以通过改变DNA的碱基、长度、浓度、处理时间等条件，对酶@Ni(ICA)2在BC膜上的富集情况的进行精准调控，作者利用位点占据效应实验揭示了DNA的连接原理。同时，BC膜的引入，也进一步方便了下游的回收利用，避免了因离心等处理手段对酶@MOF活性的影响，增加了微型反应器的可操作性。

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图3 “果枝”状Ni(ICA)2-BC自组装平台的构建

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图4 DNA精准调控Ni(ICA)2-BC的合成

作者将上述合成的Ni(ICA)2-BC微生物反应器应用于酶固定化的实际应用中，包括用于固定化脂肪酶（CRL）进行植物甾醇酯的合成、猪胰脂肪酶（PPL）和壳聚糖酶（Csn）降解壳聚糖、不稳定糖酶，肝素合酶(PmHS2)合成肝素、天然酶/纳米酶级联，葡萄糖氧化酶/磁性纳米粒级联（GOx/MNP）检测葡萄糖、多天然酶，蔗糖合酶-尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶级联（SuSy-UDH））合成糖基受体等反应体系。构建的酶@Ni(ICA)2-BC反应器平台催化效率显著提高，与传统的固定在纤维素膜纳米纤维中的酶@MOF复合材料的活性相比，活性提高了2.6~3.5倍。酶@Ni(ICA)2-BC反应器在各种催化系统中表现出多功能性和通用性，展现出作为通用型微生物反应器的巨大潜力。

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图5 酶@Ni(ICA)2-BC微生物反应器的实际应用

综上所述，本研究不仅为酶的原位固定提供了一种高稳定性的新型MOF载体，也为MOF-杂化生物材料的可控自组装设计提供了一种新的概念。这种方法预计将促进酶固定化方式从传统的无序方法过渡到精确、有组织的体系，从而加速下一代酶制剂的发展。

上述工作在线发表于Nano Letters (https://doi.org/10.1021/acs.nanolett.3c05152)。该研究得到了国家重点研发项目、国家自然科学基金项目、江苏省自然科学基金项目的支持。南京师范大学食品与制药工程学院硕士生高婉柠、南京大学化学化工学院博士生李幼聪为共同第一作者。南京师范大学食品与制药工程学院张幸教授、南京大学化学化工学院袁帅教授为通讯作者。此外，感谢南京师范大学黄和教授对该工作给予的大力支持。