在组织中，细胞处于由其他细胞和细胞外基质（ECM）构成的动态微环境中。它们通过黏着斑（FAs）与微环境进行机械互动，不仅能够施加牵引力，还能感知外部微环境的力学变化。通常，细胞的力感应是在静态环境下研究的，例如在软性材料上，细胞会产生较弱的牵引力。然而，微环境的力学性质会随时间发生变化，特别是在组织发育或疾病过程中。即便是日常活动如心跳、呼吸和消化，也会带来周期性的机械波动，而这些波动对细胞功能至关重要。尽管分子离合器模型（molecular clutch model）有效地解释了细胞如何在较硬的基质上施加更多的力，但其在解释组织和器官中的动态机械波动适应性方面仍存在局限。
近期，四川大学魏强教授和南京大学曹毅教授的联合研究团队在《Cell Stem Cell》期刊发表了一篇题为“Photo-Tunable Hydrogels Reveal Cellular Sensing of Rapid Rigidity Changes through Accumulation of Mechanical Signaling Molecules”的文章。研究团队利用具备光响应刚性的水凝胶，揭示了细胞在循环动态力学环境中对刚度变化的反应具有频率依赖性。引人注目的是，在某些频率下，细胞的牵引力甚至超过了在4倍硬度的静态基底上的牵引力，这挑战了现有的分子离合器模型。研究发现，牵引力的快速适应性与力转导信号蛋白缓慢失活之间的差异，导致了信号蛋白的积累，从而增强了细胞在动态环境下的长程牵引力。基于此，研究团队提出了一个融合了即时力传递和扩展信号的新模型，揭示了细胞通过信号蛋白的积累来感知细胞外基质刚度的周期性变化，进而增强其牵引力。这项研究强调了动态刚性在合成生物材料开发中的关键作用，突出了同时考虑即时和长期细胞反应的必要性。
为了研究细胞如何响应动态机械变化，科学家们开发了可调硬度的水凝胶。这些水凝胶揭示了细胞在不同细胞外基质硬度环境中的行为，例如细胞外基质的应力松弛会引发丝状伪足介导的细胞迁移，细胞在长期的机械刺激下能够“记忆”所接收到的力信号。然而，现有材料在硬度和频率调整方面存在局限性，难以模拟快速循环的机械信号对细胞的影响。
本研究开发了一种光响应水凝胶，能够快速且可逆地在硬态和软态之间切换。研究表明，快速周期性改变基底硬度（1分钟间隔、硬度变化28%）能够增强细胞的牵引力，甚至超过在4倍硬度但静态表面上的牵引力。进一步研究发现，这种增强与细胞内黏着斑激酶（FAK）等信号蛋白的磷酸化有关，这些力信号蛋白在细胞外基质刚度快速变化后能够持续激活并积累，增强细胞牵引力。研究还建立了一个计算模型，解释了细胞如何整合动态机械信号来调节其行为和命运。
具有动态可逆刚性切换的光响应水凝胶（图1）：
在这项研究中，研究团队开发了一种由八臂聚乙二醇（PEG）与光活性黄色蛋白（PYP）交联形成的光响应水凝胶。PYP在蓝光照射下能够快速且可逆地改变其构象，从而实现对水凝胶力学性能的可控调节。
实验结果表明，PYP的构象变化在分子水平上具有高度可逆性，并且这种变化能够显著影响水凝胶的刚度。当水凝胶接受蓝光周期性照射时，其刚度迅速降低，而当光照停止后，刚度又可以恢复。进一步实验显示，这种力学性能的变化速度极快，且可逆性极强。此外，通过调整光照强度、蛋白浓度等参数，可以精确调控水凝胶的硬度范围，提供广泛的调节空间。
图1：具有可调刚性的可逆水凝胶
基底刚度的周期性变化动态调节细胞牵引力（图2）：
研究团队利用PYP水凝胶研究了基底硬度的周期性变化对细胞牵引力的影响。将人类间充质干细胞（hMSCs）培养在PYP水凝胶上，并在不同的蓝光照射时间下测量牵引力。实验结果显示，当基底硬度在2.2 kPa和1.6 kPa之间每10分钟切换一次时，细胞的牵引力会迅速响应硬度变化，并在1分钟内达到稳定状态：硬度降低时，牵引力减弱；硬度恢复时，牵引力增加。这表明细胞能够快速感知细胞外基质的刚度变化，并通过调节细胞内黏附分子来改变牵引力。
进一步实验探讨了更长周期不同频率的蓝光照射对细胞牵引力的累积效应。结果显示，牵引力的变化与照射频率密切相关，频率越高，累积的牵引力越大。尤其是在1分钟周期下，牵引力达到了最大值，甚至超过了在4倍静态硬质基底上观测到的牵引力。相比之下，30分钟及以上的周期性变化对牵引力的影响较小。
此外，研究还发现，不同细胞类型对基底硬度变化的敏感性存在差异。快速的周期性变化不仅增强了黏着斑面积、应力纤维的形成，还扩大了细胞的扩展面积，这进一步促进了牵引力的生成。这些结果表明，与静态硬度相比，基底硬度的动态变化对细胞牵引力的影响更为显著。
图2：基底循环刚度变化对牵引力的影响
细胞牵引力的长程增强与信号蛋白的积累有关（图3）：
研究表明，细胞牵引力的维持与细胞骨架的收缩和力信号分子密切相关。FAK（黏着斑激酶）在细胞骨架收缩时，通过酪氨酸自磷酸化（磷酸化的FAK简称为pFAK），将机械刺激传递至多条信号通路。同时，Myosin IIa的丝氨酸磷酸化（磷酸化的Myosin IIa简称为pMyosin IIa）是细胞收缩单元形成和牵引力生成的关键步骤。
为了探讨基底硬度快速周期性变化后细胞牵引力增强的分子机制，研究人员通过免疫细胞化学检测了FAK和Myosin IIa的磷酸化水平。结果显示，1分钟周期的硬度变化导致FAK和Myosin IIa的磷酸化水平最高，5分钟周期次之，而30分钟周期未见显著影响。这表明，牵引力增强与力信号蛋白的磷酸化密切相关，并且这种效应依赖于硬度变化的频率和持续时间。
进一步研究发现，快速周期性硬度变化导致pFAK的积累不仅限于黏着斑部位，还遍布整个细胞。实时FRET（荧光共振能量转移）生物传感器的观察也验证了这一现象。此外，磷酸化的肌球蛋白轻链、整合素招募和总FAK水平的显著升高，进一步表明力信号蛋白的累积与细胞牵引力的增强直接相关。
图3：细胞牵引力的长程增强与信号蛋白的积累有关
力信号蛋白积累的分子机制（图4）：
研究团队进一步探讨了在周期性硬度变化下，pFAK和pMyosin IIa的磷酸化水平如何累积。力信号蛋白的积累依赖于磷酸化和去磷酸化的相对速度。为研究去磷酸化的速度，研究团队将hMSCs培养在PYP水凝胶上，并通过蓝光照射使基底软化。结果显示，在基底软化的前5分钟内，pFAK和pMyosin IIa的磷酸化水平保持稳定，但如果软化时间超过30分钟，磷酸化水平显著下降。
进一步的免疫印迹实验也表明，短时间内降低基底硬度不会显著减少磷酸化水平。此外，无论基底软化持续1、5或30分钟，当进入1分钟周期性硬化/软化循环时，磷酸化水平都会再次升高。这表明，在快速周期性硬度变化下，细胞能够重新积累这些信号蛋白。通过加入自由的RGD配体来干扰细胞与基底的连接，研究发现，pFAK和pMyosin IIa的积累显著减少，说明分子离合器的组装对信号蛋白的积累至关重要。进一步实验还表明，基底硬化和软化的时间长短及幅度都会影响信号蛋白的积累，周期性硬化与软化的平衡尤为重要。
图4：力转导信号蛋白的缓慢去磷酸化导致信号蛋白的积累
积累的信号蛋白促进机械转导和牵引力（图5）：
研究团队进一步探讨了积累的pFAK如何促进细胞牵引力的逐步增加。已有研究表明，FAK在整合素簇内被磷酸化，并间接与分子离合器相连。当分子离合器解离时，pFAK会从黏着斑中脱离并进入细胞质。蛋白组学分析结果显示，基质软化后，黏着斑（FA）和收缩单元（CU）蛋白的含量减少，但之前的实验表明，一部分pFAK在基质软化后依然保持磷酸化状态。如果这些保持磷酸化的力信号蛋白能够进入细胞质并参与下游力转导，就可能推动细胞牵引力的持续增强。
为验证细胞质中pFAK的增加是否会提高牵引力，研究团队构建了细胞质pFAK水平增强的细胞模型（OEpFAK hMSCs），并发现这些细胞展现出更高的牵引应力。同时，pMyosin IIa及其他相关信号蛋白的水平也显著升高。免疫荧光成像进一步显示，肌动蛋白纤维上的pMyosin IIa数量增加，且pMyosin IIa与肌动蛋白纤维的共定位也明显增强。这表明，即便外部机械条件相同，OEpFAK细胞能够在收缩单元中组装更多的pMyosin IIa，从而增强牵引力。此外，细胞质中pMyosin IIa的增加也表明，一部分pMyosin IIa可能滞留在细胞质中，准备与新形成的肌动蛋白纤维迅速结合，以进一步增强牵引力。
图5：积累的信号蛋白促进力转导和牵引力
物理模型（图6）：
研究团队提出了一个改进的分子离合器模型，以更全面理解细胞在快速动态基质刚度变化下的力信号转导机制。传统的力感知模型主要关注分子离合器的力传递，而未充分考虑下游机械信号转导蛋白的作用，尤其在快速变化条件下。在新模型中，研究团队引入了与刚度相关的FAK磷酸化机制，将FAK分为四种状态：细胞质中的非活性FAK、整合素簇中的非活性FAK、细胞质中的活性pFAK以及整合素簇中的活性pFAK。
通过模拟不同的基质刚度变化，研究发现，在12小时的循环基质变化后，pFAK的累积与实验结果高度一致。此外，随着频率增加，pFAK的累积量也相应提升，并在特定频率下达到最大值。该新模型能够预测不同的去磷酸化速率对细胞响应动态刚度变化的影响。实验结果表明，较快的去磷酸化速率会减少细胞在快速循环中的牵引力累积，而较慢的去磷酸化速率则有助于增加牵引力。这一发现强调了去磷酸化速率在细胞机械信号转导中的关键作用。此外，新模型还预测了基质初始刚度对牵引力增加的影响，结果显示，初始基质刚度越大，牵引力增加的幅度越小，这是因为初始的牵引力已经较高。这些预测均得到了实验验证，进一步表明了该模型的合理性与准确性。
图6：分子模型预测基底刚度快速循环变化导致pFAK积累
快速循环刚度变化的下游力学效应（图7）：
研究团队进一步探讨了快速循环基质刚度变化对细胞功能，尤其是对下游力信号转导分子的影响。结果显示，在周期性蓝光照射（1分钟开/关）下，hMSCs的YAP蛋白核-质比显著增加，且细胞核膜皱折明显减少，表明力信号的下游传递得到了加强。此外，MRTF-A和YAP的比率随着基质刚度周期变化时间的增加而上升；而当抑制细胞核与骨架连接的SUN2时，这种变化几乎消失，进一步证明了下游信号转导分子的激活与细胞机械感知机制密切相关。
间充质干细胞的成骨分化与力信号通路的增强密切相关。为进一步探究快速循环刚度变化的下游力学效应，研究团队研究了该变化对间充质干细胞成骨分化的影响。结果表明，在48小时的循环光照实验后，hMSCs的成骨分化标志物（如osterix和碱性磷酸酶ALP）显著升高，水平远高于静态条件，甚至超过了4倍硬度的静态基底，接近成骨分化培养基效果的80%。这表明快速动态刚度变化对细胞的机械反应具有显著促进作用。
实验还发现，在动态光照条件下，细胞迁移速度提高了30倍以上，细胞面积和形态也随着快速周期性刚度变化呈现周期性波动，这可能与细胞牵引力的增强有关。这些结果表明，动态基质刚度变化不仅对细胞产生长期影响，还显著改变了力信号转导的过程。未来的研究将进一步探讨这一现象背后的具体分子机制。
图7：快速循环基底刚度变化的下游力学效应
总结：
研究团队通过制备的新型光响应水凝胶（PYP水凝胶）探究了快速刚度变化对细胞力感应和信号转导的影响。结果显示，快速的基质刚度变化显著增强了细胞的牵引力，并促进了力信号的转导。进一步分析表明，当基质软化时，分子离合器解离，导致信号分子（如pFAK）从分子离合器或整合素簇中脱离并进入细胞质。值得注意的是，脱离的力信号分子不会立即去磷酸化，pFAK、pMyosin等可以继续保持5min的活性，如果在5min内恢复基质刚度，新建立的分子离合器可以用力作用磷酸化新的FAK蛋白，造成pFAK的累积。pFAK通过RhoA/ROCK通路磷酸化跟多的Myosin。而刚度的迅速恢复可以让pMyosin在失活之前，附着到重新组装的分子离合器上，增强细胞的牵引力。pFAK等信号分子在软化阶段缓慢的去磷酸化速率和刚度恢复阶段快速的磷酸化速率，是增强力信号转导的关键因素。
这项研究表明，细胞力信号转导是一个跨越多个时间尺度的复杂过程，力传递通常在秒到分钟内发生，而信号分子的磷酸化和去磷酸化则较为缓慢。未来研究将深入探讨这些时间尺度的相互作用，以进一步理解细胞如何将动态力信号转化为具体的生物学结果。这一发现对于活性生物材料设计和组织工程应用具有重要意义。
展望：
尽管PYP水凝胶已实现了目前最快的刚度变化，但生物系统中可能存在更高频率的周期性机械刺激，并对细胞和组织功能产生深远影响。因此，开发响应速度更快的生物材料对于研究这些动态生物过程至关重要。通过进一步研究和创造更先进的材料，将有助于更好地理解并模拟细胞和组织在体内所经历的复杂机械环境。
文章的第一作者是杨佳鹏博士、王鹏博士、博士生张玉，通讯作者是魏强与曹毅教授
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.stem.2024.09.016
魏强老师点评：
早在回国前，就开始思考细胞怎样感应往复力刺激。
拉伸细胞让细胞力增大的文章很多，很容易理解，因为给了细胞额外的力。一直很感兴趣让细胞力往复减小再恢复，细胞力会增大还是减小。从力平衡的角度，细胞内的力应该减小；但文献上的一些蛛丝马迹显示，细胞力是有变大的迹象的。
这个问题得到确认，是20年疫情的时候，和西安交大林敏老师讨论课题。林老师用DNA ligand体系，不断detach细胞，但是细胞的FA增强YAP入核比例增加——这是细胞力增加的标志，很违反直觉。林老师问我的看法，我讲了我的hypothesis——信号蛋白的累积，形成力的“记忆”。但林老师团队是做模拟为主，实在不想再为这个课题重做几年实验，因此只从骨架重塑角度解释了一下原因。
几个月后，我自己名下的第一个博士生王鹏入学，开始用PNIPAAm凝胶做这个课题，温敏让细胞detach。但是PNIPAAm的stiffness变化太慢且溶胀变化严重。
再过了几个月，在20年秋成都的生物物理会议上，曹毅老师告诉我了他组上几个新的细胞实验现象，想讨论可能的机制。机缘巧合，曹老师开发了一个非常敏感的光敏水凝胶，光照时stiffness在几十秒内变小，去掉光照，stiffness又在几十秒内恢复。发现一开始在stiff凝胶表面的fibroblast在凝胶循环软化之后被激活。
这正是我想找的表型！立即告诉曹老师信号蛋白累积的hypothesis。曹老师当即决定联合重新做机制研究，已经写好的文章不投了（到现在都还没投）。
我们的研究发现，不管是循环软化还是循环硬化，细胞力都会大幅增加，远超凝胶stiff状态能提供的力刺激。原因是细胞力建立很快，崩溃更快，随着软化，力平衡被打破，细胞molecular clutch立即崩溃。而FAK等信号转导关键蛋白，被力直接打开激活，因此磷酸化速率很快。但是去磷酸化需要phosphatase催化，速率较慢，磷酸化程度可在molecular clutch崩溃后继续保持5min。因此5min内重新硬化，建立新的molecular clutch，可以激活新的FAK，造成pFAK的累积，最终催化更多myosin II的磷酸化，增强细胞牵引力。该过程中，其他信号蛋白也会出现累积的现象。之后，曹老师组的同学发挥南大物理系学生的主动技能，在林敏老师的molecular clutch模型上加入FAK磷酸化速率的因素，做了新的模拟模型，得到和实验现象一致的结果。
文章投搞选择了体验Cell系列的一稿多投系统，同时投搞Cell和Cell Stem Cell。遗憾没被Cell看上，但是幸运得到Cell Stem Cell青睐，投搞到接收仅半年。刚好和曹老师一起，在西宁曹老师组织的交叉学部专题研讨会上汇报这个工作之后，第二天一早就收到预接收邮件。除了生物学机制，审稿人对光敏凝胶材料都很感兴趣。最后正式接收之前，编辑特意让在标题上体现出光敏凝胶材料。
祝贺杨佳鹏、王鹏、张玉几位为这个课题耗尽了整个博士阶段的同学。这个课题还有有意思的后续生物学现象，敬请等待。
4年前，和曹老师还讨论了另一个细胞力相关课题，还在进行中，期待能有好结果！
和曹老师的合作，实现了T01与T03的进一步交叉。