标题：Application of eDNA metabarcoding for monitoring the fish diversity of the Jiangjin to Fuling section of the upper reaches of the Yangtze River
期刊：Hydrobiologia
第一作者：程如丽
通讯作者：沈彦君
Doi: 10.1007/s10750-023-05297-1
摘要
受人为因素影响，长江流域鱼类群落处于退化状态。本研究利用环境DNA（eDNA）条技术对长江上游江津至涪陵段的鱼类多样性现状进行了调查。经过水样采集处理、高通量测序以及生物信息学分析等eDNA标准化操作分析流程后，共鉴定出鱼类104种，隶属8目、24科、72属。其中包括6种国家级保护鱼类，以及该流域特有的、外来的和以前未记录的物种。对比历史传统调查资料数据分析，本次调查结果表明，长江上游江津至涪陵段鱼类种类存在物种小型化、特有鱼类减少以及外来鱼类增加的趋势，这意味着该江段的鱼类群落还有待于进一步保护恢复。
图1 研究区域采样断面分布
前言
鱼类是水域生态系统的重要组成部分，可以通过上行和下行效应影响水域环境和各类水生生物。但由于兴建水利、挖沙采石、航道整治等一些人为因素影响，长江鱼类的濒危程度日益加剧，并且在长江流域上游受威胁的鱼类物种数最多。保护长江上游鱼类资源任务重大。
长江上游作为鱼类多样性热点研究区域，已有诸多相关调查研究。但已有研究主要是基于传统捕捞法（如刺网、地笼等）的研究结果，传统调查不仅耗时费力，并具有偶然性，对鱼体和生态环境均有害，而且难以发现一些稀少或体型较小的鱼类。快速无创的环境DNA技术通过提取环境中的DNA，选择合适的引物，结合PCR和DNA测序等分子生物学技术来对物种进行定性或定量分析。该技术在长江流域的应用也十分广泛。虽然环境DNA容易受到温度、紫外线、pH等诸多环境因素的影响，但已有研究表明，该技术的检测效率和灵敏度仍然具有较高的优势，表明环境DNA技术可作为传统监测方法的有效补充工具。
长江江津到涪陵江段全长约为200 km，包括了长江重庆段四大家鱼国家级水产种质资源保护区，以及长江上游珍稀特有鱼类国家级自然保护区与长江重庆段四大家鱼国家级水产种质资源保护区的连通江段，是长江上游的重要江段。在长江大保护的背景下，传统资源调查方法受到了局限。因此，该研究选择环境DNA技术对长江上游江津到涪陵段的鱼类种类组成展开调查，探索该技术在长江流域的鱼类监测中的适用性，以期为长江十年禁渔提供基础数据。
结果
该研究从12个采样点（图1）总共收集了5,067,423个有效序列。各采样点共享MOTUs62个，占该江段鱼类MOTU总数59.62%。根据MOTU注释分析，检测到长江上游江津至涪陵段鱼类包括8目、24科、72属、104种鱼类。本次检测结果中还包含了6种国家级保护鱼类（中华鲟、胭脂鱼、圆口铜鱼、长鳍吻鮈、重口裂腹鱼、红唇薄鳅），3种重庆市重点保护鱼类以及19种长江上游特有鱼类，此外还发现17个外来种，占总物种数的16.35%。科水平的组成结果与过去十年的传统调查结果相似，表明eDNA技术在这一流域具有一定的适用性，并可能成为传统调查方法的重要补充工具。此外，该江段“四大家鱼”的资源量表现出参差不齐的现象，其序列丰度表现为草鱼>鲢>鳙>青鱼。
图2 基于相对序列丰度的属水平鱼类组成
图3 基于eDNA（A）和传统方法（B）的科水平鱼类组成
已有研究表明，长江上游的鱼类倾向于物种小型化，该研究结果支持了这一结论。研究表明，2019年长江干流重庆段的优势鱼类包括鲢、蛇鮈和鳙。本次研究结果中小型鱼类，如张氏䱗、中华鳑鮍和麦穗鱼具有最高的相对序列丰度，这可能与禁渔前的长期过度捕捞有关，也可能较小的鱼类更活跃并脱落更多的DNA，或者结果可能与采样时间和频率有关。同时，我们发现特有鱼类有所减少，本次结果中特有鱼类占18.27%，而近十年的历史资料显示特有鱼类占24%。暗示长江上游特有鱼类正在减少，但也可能是因调查时间、方式以及范围不同引起的差异。史氏鲟、短颌鲚以及太湖新银鱼等17个外来物种在本次调查中被检测到，占物种总数的16.35%。外来鱼类可能主要来源于周围养殖场的鱼类逃逸、人为的盲目引种以及无序放生等方式。
基于鱼类生态类型的分析结果表明，长江上游江津到涪陵江段的底栖鱼类和产粘性卵的鱼类占比较高，这可能与三峡库区的形成有关系。库区的形成会导致水流减慢，水深增加，泥沙沉积，底栖鱼类的饵料生物增加，更利于底栖鱼类和产粘性卵的鱼类生存。
图4 栖息水层划分（A1基于物种数；A2基于序列数）和产卵类型（B1基于物种数；B2基于序列B2数）
为比较不同江段间的鱼类多样性差异，该研究将12个采样点分成12组（每个采样点的三个平行样归为一组），基于Bray-Curtis距离矩阵对各采样点种水平的物种组成进行NMDS分析，Stress为0.10969，表明结果具有一定的解释意义。分组样本间整体具有显著性差异（nmds1：R2= 0.210，p = 0.02；nmds2：R2= 0.58，p = 0.301）。研究结果表明，MD、XK和GYD的点比较分散且距其他采样点较远，表明这三个采样点的鱼类组成于其他采样点差异较大，这与PcoA的分析结果有一定的相似性。此外综合Bray-Curtis距离矩阵分析各采样点的PcoA分析和NMDS分析结果表明，LH、GYD、MD、ML和XK这几个采样点的鱼类物种组成较其他采样点差异较大，这可能采样点附近的河流地形与人为活动影响有关。
图5 基于Bray-Curtis距离矩阵的鱼类NMDS分析。
结论
eDNA技术在该江段检测到鱼类8目24科72属104种，科水平的物种组成与过去十年的传统调查结果相符，表明该技术具有一定的适用性，可作为传统方法的辅助工具。进一步的eDNA分析结果表明，长江上游江津至涪陵段鱼类群落趋于物种小型化，特有鱼类正在逐渐减少，外来鱼类逐渐增多。总的来说，目前长江上游鱼类资源的退化状态还不容轻视，应该持续关注并采取更多措施来保护其鱼类多样性。
该研究受国家自然科学基金和重庆市自然科学基金资助！